核苷酸序列的概率导向分离(pins)的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种分离包含已知核巧酸序列元件（即，编码保守活性位点或结构域 的序列）的复杂核巧酸片段的方法，即，该方法可适用于高通量筛选含有已知序列元件的 DNA片段。
【背景技术】 阳00引一般介绍
[0003] 分子诊断和其它WDNA为基础的方法在诸如Discovery、R&D、和诊断的各个分支 等部口已经获得了越来越多的关注。但是，不论检测或筛选所分析的是何种祀，所有的W DNA为基础的方法均面临着同样的挑战，即相对于背景DNA生成足够量的可用的祀。
[0004] 通过提高低丰度的祀DNA的存在，在W复杂的混合DNA样本中不期望的背景DNA 为代价下，能够使用传统的分子方法，诸如克隆文库构建、天然产物的发现、PCR诊断、杂交、 测序、宏基因组学、W及各种其他分子方法。
[0005]W下描述了当前使用的方法W及低丰度、混合DNA样本的挑战。
[0006] PCR诊断
[0007] 近年来，已广泛地开发了用于临床微生物中传染病的常规诊断的PCR检测。PCR适 用于直接在临床样本中细菌的快速检测，允许相关疾病的早期、灵敏和特异性的实验室确 认[1]。另外，其允许抗生素抗性基因或基因突变的存在的快速评估。组合病原体检测、它 们的耐抗生素性的机制、它们的毒力因子W及临床样品中的细菌负荷的方法能在运些感染 患者的护理中带来深刻变化。因此，当前正在开发复杂的多重PCR检测W开拓分子诊断的 领域。
[0008] 但是，从混合样品基于PCR的诊断经常与挑战相联系，因为PCR产物的存在可W源 自混合复杂样品中多于一种DNA的源。特定的抗生素基因的存在结合特定的细菌菌株的存 在并不一定意味着抗性细菌菌株存在于原始样品中。其仅表明，在样品中同时存在抗性基 因和细菌菌株，它们不一定源自相同的细胞。已经建议了防止运种问题的方法，其中通过特 异性引物祀向抗生素抗性基因的整合位点，也称为祀向特异性细菌菌株。但是，由此需要知 道准确的整合位点并且运限制了运种方法的使用。
[0009] DNA测序
[0010] DNA序列的知识在基础生物学研究和在诸如诊断、生物技术、法医生物学W及生物 系统学等许多应用领域已成为不可缺少的。使用现代DNA测序技术获得的快速测序和成本 降低一直有助于DNA序列的测序，并且全世界测序的DNA总量迅速增加。
[0011] 虽然纯样品的测序是现在的标准程序，但DNA的混合样品的测序仍然具有挑战 性、其昂贵且费时。当祀片段W较低的频率存在于混合核巧酸样品中时，例如在棉签、粪便 或血液样品中，首先必须做出克隆或片段文库，然后对所述完整的文库进行测序，或者做出 更小的PCR片段并且对其进行测序。完整文库的测序昂贵且耗时，而PCR片段的测序仅在 所述序列在非常大的程度上是已知的条件下才是可能的并且会返回相对短的片段，运种相 对短的片段不能被分配到同一分子或生物体。如果仅知道祀序列的一部分，那么PCR将是 不可能的并且需要宏基因组测序。
[0012] 因此，需要一种用于提高核巧酸分子的混合样品中的稀有核巧酸分子的频率的方 法，W便降低测序混合样品的成本和时间。
[0013] 宏基因组学
[0014] 宏基因组学是指一般的测序方法，其中将DNA的复杂混合物区分为小的片断 (化actions)并且单独地测序。该系统不依赖于培养性并因此同时适用于可W及不可W在 实验室培养的样品。
[0015] 虽然宏基因组学在某些情况下可W被应用到所描述的复杂样品，但是经常的情况 是，研究人员更偏好基因组的或基因组混合物的特定子集，而非基因组的一个样品或混合 样品的整个序列巧]。因此，仍然强烈需要灵活的祀向方法，其匹配各种技术和研究的个性 化要求。虽然此种技术确实存在，但是它们经常基于杂交试验，并且W具有广泛的序列知识 为前提条件或者具有低的灵敏度。
[0016] 因此，如果宏基因组学旨在用于分析稀少的/低丰度的DNA片段或祀，则存在对复 杂混合物中预定义的子片断的特异性富集的强烈需求。
[0017] 发现
[0018] 不同的行业有不同的动机，W探索处于未发掘的微生物多样性中的广麦的资源。 当前，白色（工业）生物技术似乎在可持续发展的现代社会的建立中发挥了核屯、作用。一种 普遍接受的假设是，只有天然微生物生物多样性的一个小的细分可用于筛选。在1990年， Torsvijketal. [3]估计，充其量只有1%的±壤样品的天然存在的微生物多样性可W在 实验室条件下培养。因此，在尚未知的天然产物的发现中W及在使得能够进入存在于天然 和环境样品的未知的大多数DNA的生物技术中存在巨大的潜力。遗憾的是，如果要获取那 些W其它方式无法获得的信息，则需要大量的测序。
[0019] 编码工业相关蛋白质或酶的DNA片段的祀向富集将大大减少所需的测序量。
【发明内容】
[0020] 本发明提供了用于从混合的多核巧酸样品富集和/或分离祀DNA分子的体外方 法，其包含步骤：
[0021] a)提供含有所述祀DNA分子的混合核巧酸样品，其中所述祀DNA分子包含一个或 多个至少10个核巧酸的独特连续序列（uniqueconsecutivesequence),
[0022] b)连续稀释所述混合多核巧酸样品直至在稀释的样品中检测所述祀DNA分子的 概率低于0. 75,优选低于0. 50或甚至更优选地低于0. 25,和
[0023] C)复制足够数量的稀释的样品直至在至少一个所述复制稀释样品中检测所述祀 DNA分子的概率为至少0. 75,优选0. 80~0. 95 ;
[0024] d)扩增所述复制稀释样品中的DNAW提高每个样品中的DNA丰度；
[0025]e)检测所述祀DNA分子在步骤（d)中扩增的所述复制稀释样品中的存在或不存 在，其中所述祀DNA分子在所述复制稀释样品中的频率与步骤（a)中的混合多核巧酸样品 相比被提局；
[00%]f)连续稀释含有所述DNA分子的至少一个复制稀释样品直至在稀释的样品中检 测所述祀DM分子的概率低于0.75,并且重复步骤（c)至（e)或（f)至少一次。
【附图说明】
[0027]图 1 :
[0028] 本图示出了来自初始混合物的九个阴性PCR反应的2%琼脂糖凝胶。框出区域指 示在凝胶中将存在阳性PCR产物。框外部的PCR产物为非特异性产物且在本上下文中被忽 略。
[0029]图 2 :
[0030] 本图示出了在第一轮PINS之后的十个PCR样品的2%琼脂糖凝胶。五个样品（A、 B、C、D&I)含有预期大小的PCR产物，而剩余的五个样品则不含有。在凝胶中用箭头标识了 正确的产物大小（左侧）。其它位置的PCR产物（未用箭头标识的）为非特异性产物且在 本上下文中被忽略。
[0031]图3: 阳0巧本图示出了在样品#10再扩增后的十个PCR样品的2%琼脂糖凝胶。六个样品（A、 C、E、F、I&J)含有预期大小的PCR产物，而剩余的四个样品则不含有。在凝胶中用箭头标识 了正确的产物大小（左侧）。其它位置的PCR产物（未用箭头标识的）为非特异性产物且 在本上下文中被忽略。
[0033]图 4 :
[0034] 本图示出了在PCR之前使用沈-1稀释的第二轮PINS后的十个PCR样品的2%琼 脂糖凝胶。五个样品（C、D、E、G&I)含有预期大小的PCR产物，而剩余的四个样品则不含有。 在凝胶中用箭头标识了正确的产物大小（左侧）。其它位置的PCR产物（未用箭头标识的） 为非特异性产物且在本上下文中被忽略。
[0035]图 5 :
[0036] 本图示出了使用下列参数的两轮PINS的示意图：
[0037]A:初始样品-具有 0. 028ng/y1。 阳03引 B:10Phi样品，由A创建，使用3. 5y1 "A"作为模板。
[0039] C: 一个样品，（S个中）全部3个PCR产物为阳性。 W40]D:通过使用3. 5y1样品#10在50的总反应体积中再扩增的样品"C"。
[0041] E:10Phi样品，在每个反应中使用1. 0y1作为模板由"D"创建。
[0042]F&G :两个样品，其中（S个中）全部3个PCR产物均为阳性。 W43] H:合并样品"F，，& "G，，。
[0044] I:增益，计算为从初始浓度到第一轮PINS后的结果。
[0045]J:增益，使用在相同稀释度下的直接比较，从第一轮PINS计算至第二轮PINS。
[0046] K:增益，使用在不同稀释度下的比较，从第一轮PINS计算至第二轮PINS。
[0047]L :增益，从初始样品计算至完成（祀/ng)。
[0048]图 6:
[0049] 本图示出了从包含祀HPV18-DNA分子的初始混合多核巧酸样品产生的十个阴性 PCR反应的2%琼脂糖凝胶。框出区域指示了在凝胶中将会存在阳性PCR产物。框外部的 PCR产物为非特异性产物且在本上下文中被忽略。 阳化0] 图7 :
[0051] 本图示出了设计用于检测祀HPV18-DNA分子的存在的S个PCR的产物的2%琼脂 糖凝胶。泳道#1为阳性对照PCR反应；泳道#2为PINS(MDA-介导的）富集的含有2. 5祀 拷贝/y1的混合核巧酸样品的PCR产物；且泳道#3为阴性PCR对照。箭头指示了~66化P 的DNA分子在琼脂糖凝胶中的相对迁移率。
[0052]图 8 :
[0053] 本图示出了通过再扩增图7中所示的祀HPV18-DNA分子获得的PCR产物的2%琼 脂糖凝胶。箭头指示了~66化P的DNA分子在琼脂糖凝胶中的相对迁移率。
[0054] 图 9 : 阳化日]PINS富集的祀HPV18-DNA分子的检索序列与HPV18序列（HPU89349)的比对，显示 所述序列完美一致，零错配。
[0056] 图 10 :
[0057] 检索到的编码内切葡聚糖酶（endoglucanase)的微生物基因的序列的引物和局 部比对。
[0058]图 11 :
[0059] 本图示出了通过PINS富集的编码内切葡聚糖酶的基因的核巧酸序列。用于RGW 的限制性位点（MboI、EcoRI和化ndlll)被插入到框中。-35&-10示出了推定的启动子位 点的位置且SD为核糖体结合位点（ShineDalgarno)位置。EndoGlu-Fw&EndoGlu-Re为在 PINS过程中使用的引物。0RF指示了开放阅读框的位置。
【具体实施方式】 W60] 本发明设及一种体外方法，其中含有目标DNA片段（所关注的DNA片段，DNA 化agmentofinterest)的祀核巧酸序列的频率被逐步增加，其通过多轮1)在多个复制品 (复制体，replicate)中稀释含有目标DNA片段的样品（分离）、2)随机扩增复制品中的 DNA(浓缩）、3)在至少一个稀释并扩增的复制品中检测目标DNA片段（选择）并且重复步 骤1)~3)直到通过标准的测序技术能够对目标DNA片段进行测序。
[0061] 本发明基于的原则是：如果存在于混合样品中的所选定的目标DNA片段所处于的 稀释度下寻找它的概率较小，那么所述目标DNA片段在该稀释度下的频率比在混合样品中 的高，并且其频率可W进一步通过多轮选择（如上所述）来增加，直到其可W通过标准方法 诸如Sanger测序或焦憐酸测序或类