杂环蒽酮类组蛋白甲基转移酶抑制剂及其医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化学领域，具体设及一类杂环蔥酬类组蛋白甲基转移酶抑制剂、 其制备方法及其医药用途。
【背景技术】
[0002] 组蛋白甲基化修饰是一种重要的表观遗传学调控方式，参与染色质构象的调控、 基因的转录和表达。组蛋白的甲基化水平与多种原癌基因和肿瘤抑制基因密切相关，组蛋 白的甲基化水平的异常使得运些原癌基因和肿瘤抑制基因非正常表达，可能会导致肿瘤的 发生。因此，通过调节组蛋白的甲基化水平，某些重要基因得W转录，W达到治疗肿瘤的目 的。组蛋白甲基化调节蛋白已成为目前肿瘤药物研发领域最新、最热口的祀标。
[0003] 组蛋白甲基转移酶主要的作用底物是组成核小体的组蛋白。在人体内，组 蛋白末端的赖氨酸和精氨酸残基会被甲基化。组蛋白精氨酸甲基化是由两类甲基 转移酶催化完成的：1类精氨酸甲基转移酶和II类精氨酸甲基转移酶。另一类组蛋 白甲基转移酶主要作用于组蛋白的赖氨酸，称作组蛋白赖氨酸甲基转移酶化ysine meth^transferases,KMTs)。与其它的转录后修饰不同，组蛋白甲基化可W有二甲基化、 S甲基化，因此，甲基化的进程更加复杂（MosammaparastN,ShiY.Reversalofhistone methylation:biochemicalandmolecularmechanismsofhistonedemethylases[J]. AnnuRevBiochem, 2010, 79:155-179.)组蛋白甲基转移酶能够利用辅因子S-腺巧甲硫氨 酸（S-adenosylmethionine,SAM)作为甲基供体催化组蛋白N-端赖氨酸残基，使其增加 1-3个甲基。到目前为止组蛋白赖氨酸的甲基化影响基因转录的具体机理尚未研究清楚，其 更多的生物学功能有待进一步阐释。组蛋白赖氨酸甲基转移酶在众多生理过程中发挥着重 要作用。例如，细胞的分化和发育，衰老过程的调节，基因组稳定性的控制，神经元功能的调 节和肿瘤细胞的增殖。组蛋白甲基转移酶不仅可W作用于组蛋白，还可W使非组蛋白底物 甲基化。与癌症相关的p53可W被KMTs甲基化。p53的373位赖氨酸甲基化后，减弱p53动 态信号的传递，最终导致肿瘤细胞不可控的生长（WestLE,Gozani0.Regulationofp53 functionbylysinemethylation[J].E；pigenomics,2011, 3(3) :361_369)有研究表明，组 蛋白甲基转移酶在结肠癌，肝癌，乳腺癌细胞中表达异常。此外，在白血病、前列腺癌、肺癌 和腮腺癌中都可观察到组蛋白甲基转移酶的过表达。
[0004] 考虑到组蛋白甲基转移酶的重要功能，尤其是在肿瘤发生发展过程中起着至关重 要的作用，因此将组蛋白甲基转移酶作为抗肿瘤祀标是非常有前景的。目前报道的组蛋白 甲基转移酶抑制剂根据来源主要分为两大类：一类为天然产物类抑制剂，一般是从真菌中 提取的抗生素类化合物。主要是毛壳素（chaetocin)类化合物，该类化合物包含有环二硫 酬赃嗦类结构；另一类为人工设计合成的小分子抑制剂，目前报道的小分子抑制剂WSAM 的类似物居多，另有苯并咪挫类，哇挫嘟类化合物报道。
[0005] 组蛋白甲基转移酶抑制剂根据作用方式的不同分为底物竞争性抑制剂和SAM竞 争性抑制剂。到目前为止组蛋白甲基转移酶抑制剂的研究绝大多数处在临床前阶段。所W 研发选择性的组蛋白甲基转移酶抑制剂，无论对学术研究还是对开发其临床应用的可能性 都具有非常重大的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明设及一类基于组蛋白甲基转移酶设计的杂环蔥酬类的衍生物，药理学实验 证明本发明化合物对组蛋白甲基转移酶从分子水平到细胞水平具有良好的抑制作用，对肿 瘤细胞株具有良好的抗增殖活性，具有合理的成药性参数，如适合的解离常数（pKa)、脂水 分布系数（Lo曲，抑=7. 4)、水溶性及膜透过率。药代动力学的研究表明本发明化合物在 大鼠体内分布较广，血浆清除率处在可接受的范围内，且具有较好的生物利用度。本发明化 合物及其药物制剂可W用于治疗由于组蛋白甲基转移酶酶活性失调而导致的一系列疾病， 例如，实体瘤，白血病、追疾W及神经退行性等疾病。
[0007] 本发明设及下列通式（I)的化合物
[0008]
[0009] 其中Ar代表
[0010] W代表C、N、0或S;
[0011] L代表Ci-Ce的碳链；
[001引Ri代表面素、径基、-NRA、硝酸醋基、硫氯基、Ci-Ce烷氧基、C2-Ce不饱和締氧基、Ci-Ce烷基酷氧基或取代的Ce-Cs苯基酷氧基，所述取代基是氨、面素、甲氧基、硝基、径基或 NRA；
[001引R2代表-NRA、被0-2个Z取代基取代的苯基、含有1-2个选自N、0或S的五元、 六元饱和或不饱和杂环或者含有该不饱和杂环的苯并杂环，其中取代基Z基是面素、氨基、 径基、硝基、氯基、簇基、Ci-Ce的烷基、Ci-Ce的烷氧基或Ci-Ce的烷基胺基；
[0014] Ra、Rb各自独立代表H、c1-Ce烷基、C1-Ce径烷基或C1-Ce烧酷基；或Ra、Rb连接形成 含有1-2个N或0原子的5-6元杂环；
[0015] Rs代表单、双或S取代，取代基为H、面素、C1-C3烷氧基或C1-C3烧硫基。
[001引Ar优选代赛
[0017]Ri优选代表-NRaRb，其中R。、Rb各自独立地代表H、甲基、乙基、丙基、异丙基、正下 基、径乙基或径丙基；或者R。、Rb连接形成四氨化咯基、咪挫基、赃晚基、4-氧代赃晚基、吗啡 嘟基、赃嗦基、N-甲基赃嗦基、N-甲基高赃嗦基、N-乙基赃嗦基，N-丙基赃嗦基、N-异丙基 赃嗦基、N-环戊基赃嗦基、N-环己基赃嗦基、N-苯基赃嗦基、N-苄基赃嗦基或N-喀晚基赃 嗦基。
[0018]R2优选代表-NRaRb，其中R。、Rb各自独立地代表H、甲基、乙基、丙基、异丙基、正下 基、径乙基或径丙基；或者R。、Rb连接形成四氨化咯基、咪挫基、赃晚基、4-氧代赃晚基、吗 啡嘟基、赃嗦基、N-甲基赃嗦基、N-甲基高赃嗦基、N-乙基赃嗦基、N-丙基赃嗦基、N-异丙 基赃嗦基、N-环戊基赃嗦基、N-环己基赃嗦基、N-苯基赃嗦基、N-苄基赃嗦基；或2-氣苯 基、3-氣苯基、4-氣苯基，2, 4-二氣苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-=氣甲氧基苯基， 2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基，2, 4-二氯苯基或3-氣-4-氯苯基。
[0019]R3优选代表单、双或=取代基，取代基选自氨、氯、甲氧基或甲硫基。
[0020] 更优选下列任一结构的化合物或其药学上可接受的盐：
[0021]
[0022] 通式（I)化合物及药学上可接受的盐或溶剂化物都包括在本发明范围内。
[0023] 本发明化合物（I)可用下列方法制备：
[0024]
[00巧]首先适当的商业购买的原料1经过漠代得到中间体2,中间体2在AICI3作用下和 商业购买的各种
受生取代反应得到中间体3,随后目标化合物由中间体3和商业网 购买的各种Ri发生取代反应得到。
[0026] 通式（I)所述化合物及其中间体可W通过常见的分离方法进行纯化，如重结晶、 柱层析等。
[0027] 本发明还公开了一种药物组合，通式（I)化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化 物可W添加药学上可接受的载体制成常见的药物制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬 浮剂、针剂，可W加入香料、甜味剂、液体或固体填充料或稀释剂等常用的药物辅料。
[0028] 本发明所述的化合物在临床上的给药方式可W采用口服、注射等方式。
[0029] 本发明的化合物（I)临床所用剂量为0.0 lmg~lOOOmg/天，也可根据病情的轻重 或剂型的不同偏离此范围。
[0030] 下面是本发明化合物的部分药理学实验及结果，药理部分的化合物代号所对应的 结构式等同于实施例部分的代号所对应的结构式：
[0031] 一、对组蛋白甲基转移酶的抑制实验
[0032] 材料试剂及仪器：384孔不透明黑板，Biotinylatedhistone册peptide、SAM与 组蛋白甲基转移酶；特异性识别甲基化位点的一抗及相应的抗鼠微珠，Streptavidin偶联 的微珠，AlphaScreenmicroplatereader酶标仪。
[0033] 组蛋白甲基转移酶抑制活性测定方法：将Biotin^atedhistone册趴ptide、 SAM与组蛋白甲基转移酶混合，同时加入不同浓度的通式（I)化合物，每个浓度做=个复 孔，在室溫下反应60分钟后，加入特异性识别甲基化位点的一抗及相应的抗鼠微珠，混 匀后，室溫解育90分钟，最后加入Streptavidin偶联的微珠，混匀并解育30分钟后，在 Perki址Imer公司的A1地aScreenmicroplatereader酶标仪上检测相应的TR-FRET信号。
[0034]数据分析方法：a)计算每个样本的平均信号值；b)每个样本浓度的信号值减去背 景信号值，C)计算每个样本的抑制率。
[0035] %抑制率=(A药物-A本底）/ (A对照-A本底）X100 %
[0036] 用GraphpadPrisms软件处理，计算出化合物的ICs。值
[0037] 表1本发明代表化合物对组蛋白甲基转移酶的ICs。
[0038]
[0039] 二、对肿瘤细胞的体外抗增殖实验
[0040] 测试本发明化合物对人类结肠癌细胞株HCT116,人类乳腺癌细胞株MC巧及人肝 癌细胞化巧G2)的抗增殖活性。方法：共选用S种肿瘤细胞（肥T116,MCF7,化pG2)。将细 胞接种于96孔的平板中（每孔约有4000-10000个细胞），24小时后，将不同浓度的化合物 加入至细胞中，72小时后，各小孔中分别加入20yLM1T的PBS溶液（浓度为5mg/mL)，于 37°C解育4小时，除去MTT，每个小孔中分别加入150yLDMS0(含量为100% )，于570皿下 检测（采用化ermoMultiskanSpectrum)。其中UNC0638是目前报道的酶活和细胞活都较 好的小分子抑制剂，被广泛应用为阳性对照。
[0041] 表2本发明代表化合物对不同肿瘤细胞株的抗增殖活性
[0042]
[0043]
[0044]=、在细胞内对组蛋白底物的甲基化水平影响实验
[0045] 测试本发明化合物在人类乳腺癌细胞株MCF7中对组蛋白底物甲基化水平的影 响。方法：蛋白免疫印迹WesternBlot。将细胞接种于细胞培养瓶中，于37°C，％含量 5%的解箱中培养24h后，将不同浓度的化合物加入至细胞中培养24小时后，收集细胞 (2.5*105)，使用细胞裂解液RIPA进行细胞破碎进行蛋白提取，BCA方法测定蛋白浓度，进 行SDS-PAGE凝胶电泳，分别对目的条带进行一抗4°C过夜解育，TBS缓冲液洗涂，二抗解育， 应用OdysseyInfraredImagingSystem进行目的蛋白的检测。
[0046] 图1和图2分别代表化合物CPUY074017和CPUY074020对册脚me2和册脚me3甲 基化水平的影响。
[0047] 上述药理实验结果显示：本发明化合物对组蛋白甲基转移酶表现出显著的抑制作 用，部分化合物的抑制活性（ICJ处于较低微摩尔水平。运对新型骨架的组蛋白甲基转移 酶抑制剂的发现及其作用机制的研究都有重要意义。
[0048] 本发明化合物对肿瘤细胞肥T116,MC巧和化pG2细胞具有较好的抗增殖活性，其 中部分化合物的抗增殖活性甚至高于阳性对照UNC0638。
【附图说明】
[0049] 图1是CPUY074017对册脚me2和册脚me3甲基化水平的影响
[0050] 图2是CPUY074020对册脚me2和册脚me3甲基化水平的影响
【具体实施方式】
[00川实施例1
[005引 3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬的制备
[0053]
[0054] 将6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬巧g，22.eOmmol)溶于AcOH巧0血）中，同时将 漠化90mL，56. 51mmol)的醋酸溶液滴加至反应液中，TLC检测，反应停止。将该反应液 用饱和碳酸氨钢调至弱碱性，用二氯甲烧（3X50mL)萃取，有机层用无水硫酸钢干燥，旋 干溶剂，柱层析分离得到黄色3,5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬（7. 26g，73% ). m.p. 247-248r.巾NMR(300MHz，CDCls) :68. 45 (d，J二 7. 71Hz，IH，ArH)，8. 08 (d，J二 7. 5Hz，IH，Ar田，7. 97 (s，化，ArH)，7. 82 (t，J= 7. 23Hz，IH，ArH)，7. 72 (t，J=7. 3甜z，ArH). HRMS(ESI):calcdforCi4HsBr2N〇2[M+H]+377. 8760,found377. 8752.
[0055] 实施例2
[0056]
阳〇57]将不同取代的氨溶解在溶有无水氯化铅的二氯甲烧溶液中，实施例1化合物加入 到该混合物中，于4(TC揽拌12h，TLC检测，停止反应。将该反应液用水（2X30mL)萃取。有 机层用无水硫酸钢干燥，旋干溶剂得到红色固体。
[0058] W下化合物（实施例3-11)均按照上述方法由实施例2经取代反应合成。
[00则实施例3
[0060] 3-漠-5-((4-甲氧基苯基）氨基）-6H-慈[l，9-cd]异恶嗤-6-丽的制备
[0061]
[0062] 3, 5-二漠-6H-蔥[1，9-cd]异恶性-6-丽（0.lOg, 0.26mmol)和对甲氧基苯 胺（；0. 19g,l.SSmmoU按照实施例 2 方法合成。m.P. 156-157°C.ifiNMR(300MHz，CDCl3) :6ll. 32(s，lH，NH)，8. 58(d，J= 7. 23Hz，lH，ArH)，8. 18(d，J= 7. 23Hz，ArH)，7.82(t，J = 7.47Hz，lH，ArH)，7.70(t，J= 8.01^，lH，ArH)，7.62(s，lH，A^)，7.30(d，J= 8. 79Hz，2H，Arii)，7. 05 (d,J=8. 85Hz，2H，ArH)，3. 91 (s，地，甜3).HRMS(ESU:calcdforC2 iHi3BrN2〇3[M+H]+421. 0182,found421. 0186.
[0063]实施例4
[0064] 3-漠-5-((4-甲基苯基）氨基）-6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬的制备
[00 的]
[^066]本品由3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]异恶嗤-6-酬（0.lOg,0.26mm〇l)和对甲基苯 胺（0. 17g, 1. 58mmol)按照实施例 2 方法合成。m.P. 197-198°C.屯NMR(300MHz，CDCI3) : 5 11. ：35 (S，1H，畑），8. 54 (d，J= 7. 68Hz，1H,ArH)，8. 14 (d，J= 7.化化，1H，Aril)，7. 79 (t，J= 7. ：35Hz，IH，ArH)，7. 67 (t，J= 5. 79Hz，2H，ArH)，7. 32 (d，J二8. 19Hz，2H，ArH)，7. 25 (d，J= 8. lOHz，2H，ArH)，2. 43 (s，3H，紐3).HRMS(ESI) :calcdforC2化3BrN2〇2[M+H] +405. 0233,foun d405. 0229.
[0067] 实施例5
[0068] 4-((3-漠-6-氧一6护蔥[1，9-(：(1]异恶挫-5-基）氨基）苯甲腊
[0069]
[0070] 本品由3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬〇).lOg, 0. 26mmol)和对氯基苯 胺 〇). 18g, 1. 58mmol)按照实施例 2 方法合成。m.P. 179-180°C.电NMR(300MHz，CDCI3) : 5 11.45(s, 1H,畑），8.55 (d，J= 7.47Hz,IH'ArH),8. 19 (d，J= 7.47Hz, 1H,ArH), 7. 88-7. 81 ( m, 4H,ArH)，7. 74 (d,J=8. 37Hz,IH,ArH)，7. 49 (d,J=8. 55Hz, 2H,ArH).HRMS(ESI) :calcd forC21H10化N3O2DM+田+416. 0027，found416. 0031.
[00川实施例6
[007引 3-漠-5-((4-氯苯基）氨基）-6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬的制备
[0073]
[0074]本品由 3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]异恶挫-6-酬 〇).lOg, 0. 26mmol)和对氯苯 胺（0. 20g, 1. 58mmol)按照实施例 2 方法合成。m.P. 189-190°C.咱NMR(300MHz，CDCI3) : 5 11. 33(S,1H,畑），8. 56 (d,J= 7. 23Hz,