海洋链霉菌环二肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及环二肤，尤其是设及海洋链霉菌环二肤及其制备方法。
【背景技术】 W02] 环二肤，又称为2, 5-二酬赃嗦，2, 5-二氧赃嗦，或二肤酸酢，由两个氨基酸 通过肤键环形成，其典型结构中包含一个二酬赃嗦。环二肤具有特别稳定的六元环结 构和构象约束作用，运一结构在药物化学研究中是一类重要的药效团（[l]Mcdowell RS,GadekTR.StructuralstudiesofpotentconstrainedRGDpeptides[J].JAm 化emSoc，1992, 114(24) :9245 ;[2]赵喜梅.环二肤与一价金属离子的相互作用识别研 究巧].郑州：郑州大学，2010:85.)。环二肤来源很广，有些是动植物中生来就有的， 有些是通过发酵或者在食品加工过程中产生的。环二肤被发现普遍存在于蛋白及多肤 水解物，W及动植物、酵母、原生生物、真菌、海洋生物中。由于来源不同，环二肤的生物 活性也不同，目前发现的环二肤因其较强的生物活性而被人们广泛关注，例如，环二肤具 有影响胞间信息传递、抑制毒素、促进癌细胞调亡、镇痛、抑制致病微生物等作用（[3]强 薇，梅刚.真菌中环二肤及其衍生物的抗肿瘤活性研究进展[J].长沙：中南大学药学 院，2014. 25(21) :2007-2009 ; [4]卢犧元，徐德昌.环二肤生物活性的研究进展[J].生物 信息学，2011，9(4) : 289-291.)。
[0003] 由于海洋环境存在低溫、高压、寡营养、高盐等特点，使海洋微生物可能产生出结 构新颖多样、活性独特的天然产物，因此引起了许多科学家的关注。目前已经从海洋细菌、 海洋放线菌、海洋真菌、红树林叶内生真菌的代谢产物中已分离出大量的具有生物活性的 环二肤类化合物。
[0004] 目前国内外研究机构大多通过有机溶剂萃取、凝胶柱层析、一系列正相和反相色 谱柱和高效液相色谱等现代分离技术来分离环二肤类化合物（[引宫俊，汤华，耿婉丽， 刘宝妹，孙鹏，李玲，李志勇，张文.仿刺参共附生放线菌化evibacteriumsp.中的环 二肤成分的分离和鉴定[J].第二军医大学学报，2012, 33 (12) : 1284-1287)。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于提供一种链霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054。
[0006] 本发明的第二目的在于提供两种海洋链霉菌环二肤及其制备方法。
[0007] 本发明的第=目的在于提供两种海洋链霉菌环二肤的应用。
[0008] 所述链霉菌（Streptomycessp. )HNS054已于2014年03月20日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏中屯、登记入册编号：CGMCCNo. 8946。
[0009] 所述两种海洋链霉菌环二肤分别是环（脯-酪）二肤和环（脯-鄉）二肤。
[0010] 所述两种海洋链霉菌环二肤的制备方法如下：
[0011] 1)获得肤类粗提物，具体方法为：
[0012] 先发酵海洋链霉菌，得海洋链霉菌发酵液，再通过连续流离屯、，错流过滤，5K滤膜 切向流过滤，得发酵液上清，发酵液上清经大孔树脂吸附和解吸附获得肤类粗提物；将肤类 粗提物经旋转蒸发浓缩后直接进行纯化，或再经冷冻干燥W粉末状态避光低溫长期保存；
[0013] 2)经乙腊-水浓度梯度反相HPLC制备，获得多个组分，再经旋转蒸发浓缩后直接 进行纯化，或再经冷冻干燥W粉末状态避光低溫长期保存；
[0014] 3)将各组分通过乙腊-水等度反相HPLC分离获得纯肤，经旋转蒸发和冷冻干燥后 W粉末状态避光低溫长期保存。
[0015] 在步骤1)中，所述发酵海洋链霉菌所用的培养基可为2216E培养基，2216E培养基 的配方为：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高铁0.Olg，琼脂：15~20g，抑：7. 4~7. 5,无菌海水 1000ml，高压蒸汽灭菌：12rC，20min;发酵的条件为：28°C，165rmp，9化；
[0016] 所述切向流过滤可采用PA化Centramate超滤系统，先用MWC0300K膜包滤去大分 子，滤过液再用MWC05K膜包滤过小分子蛋白/肤类；需要注意的是膜包标称的滤过或截留 孔径大小要经过实验验证，标称10K的膜包在实际中会滤过部分10~20K的蛋白；
[0017] 所述大孔树脂可采用型号为NKA-9的大孔树脂，可采用郑州勤实科技有限公司产 品；
[0018] 所述大孔树脂吸附和解吸附的流程是：将处理好的大孔树脂W1 : (3~20)体 积比与切向流滤过液混合，4°C下，通过摇床、磁力揽拌、机械揽拌等方式连续揽拌10~ 1地，之后用去离子水漂洗大孔树脂5次W上，将大孔树脂装入层析柱用层析系统在280nm 或215nm波长检测肤类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇质量百分浓度至75 %，最后用50mM 化OH洗脱，收集40 %~75 %乙醇洗脱组分。
[0019] 在步骤2)中，所述乙腊-水浓度梯度反相HPLC制备可采用C18反相柱Welch 叫timataXB-C18,内径30mm，高度250mm，填料粒径10ym，孔径辨:〇A，所用的流动相按质 量百分比含0. 1 % =氣乙酸；上样样品用起始乙腊浓度的含0. 1 % =氣乙酸的水溶液溶解。W20] 在步骤如中，所述乙腊-水等度反相HPLC分离可采用反相柱YMC-Pack 0DS-A250X10mm，填料粒径5ym;每次上样40ul，流速1.0血/min;16%乙腊等度洗脱；检 测波长 280nm、210nm、254nm、230nm。
[0021] 所述环（脯-酪）二肤对乳腺癌、宫颈癌和结肠癌有抑制作用，同时还有免疫活 性、调节激素及调控能量代谢的作用；所述环（脯-鄉）二肤抗媛弧菌作用（MIC为0.05); 体外抗肿瘤活性（13. 3± 1. 6) %巧ug/ml);质量浓度为50yg/ml时对前列腺癌细胞的生长 抑制率约为53% ;对肝癌细胞的抑制率约为17%。
[0022] 本发明W链霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054为菌种，经过斜面培养、平板培养、液 体发酵培养、分离和提纯，最后获得本发明的两种环二肤。
[0023] 本发明提供一种大孔树脂NKA-9吸附和解吸附与高效液相色谱法相结合的分离 环二肤的方法。本发明步骤简洁，操作简单，整个分离流程仅需9化便可获得纯环二肤；本 发明所用NKA-9大孔树脂相较于传统分离方法所用的凝胶、C18或C8等材料价格低廉。本 发明提供的分离环二肤方法能高效低能的分离出纯环二肤，对环二肤类物质的研究具有重 要意义。
[0024] 本发明所用菌株产次级代谢物周期短，所产代谢物活力高，是一株生产性能优良 的菌种。本发明设及到的海洋链霉菌环二肤制备方法高效而廉价、处理通量高，易于放大。
【附图说明】
[0025]图1为实施例2大孔吸附树脂NKA-9的洗脱曲线。
[00%] 图2为实施例2第二级分离洗脱曲线。
[0027] 图3为实施例3中化合物C-1-0的iH-NMR数据图。 阳02引 图4为实施例3中化合物C-1-0的"C-NMR数据图。
[0029] 图5为实施例3中化合物C-1-0的质谱信息。
[0030] 图6为实施例3中化合物C-1-0化学结构。
[0031] 图7为实施例3中化合物C-1-1的iH-NMR数据图。
[0032] 图8为实施例3中化合物C-1-1的"C-NMR数据图。 阳03引图9为实施例3中化合物C-1-1的质谱信息。
[0034]图10为实施例3中化合物C-1-1的化学结构。
【具体实施方式】 阳0对实施例1
[0036] 1、菌种：海洋链霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054,保藏号为CGMCCNo. 8946。
[0037] 2、发酵及发酵条件：
[003引 （1)、平板培养基：酵母膏：4g，麦芽浸膏：10g，葡萄糖：4g，琼脂：20g，无菌海水： 1L，抑：7. 3,高压蒸汽灭菌：110°C，30min。
[0039] 平板培养条件：28°C培养5~7d。
[0040] (2)种子培养基：蛋白腺：5g，酵母膏：lg，憐酸高铁：0.01g，琼脂：15~20g，无菌 海水：1000ml，抑：7. 4 ~7. 5。
[0041] 培养条件：转速为：165rmp，28°C震荡培养3d，作为液体种子。
[0042] (3)发酵培养基：蛋白腺：5g，酵母膏：lg，憐酸高铁：0.Olg，琼脂：15~20g，无菌 海水：1000ml，抑：7. 4 ~7. 5。 阳0创培养条件：转速为165rmp，28°C震荡发酵4d。 W44] 实施例2 W45] 1、斜面培养同实施例1 ;
[0046] 2、种子培养同实施例1;
[0047] 3、发酵培养同实施例1 ;
[0048] 4、海洋链霉菌环二肤的分离纯化： W例 （1)、HNS054在化锥形瓶中发酵化X5瓶，连续流离心错流过滤，5K滤膜切向流 过滤得发酵液上清。
[0050] 似、在4°C层析柜中，约13LMWC05K膜包滤过液与500血NKA-9大孔吸附树脂磁 力揽拌过夜（1化)，吸附后的大孔树脂用500mL去离子水漂洗10次； 阳05U (3)、将树脂装入5. 5cmX50cm层析柱，纯水3血/min继续漂洗300ml，然后依次W 10%、25%、40%乙醇311117111111各 3001111，50%、60%乙醇311117111111各1001111，75%乙醇洗脱 300ml，50mMNaOH3mL/min洗脱30