一种具有反硝化功能的除烃海杆菌stw2及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物领域，具体设及一种具有反硝化功能的除控海杆菌STW2及其 应用。
【背景技术】：
[0002] 由于经济的发展和城市化进程的推进，人类活动在滨海湿地生态系统区域日益频 繁，使得越来越多的无机污染和有机污染物质进入到滨海湿地系统中，对生态系统造成严 重的破坏，其中比较常见的是无机氮污染和多环芳控、农药、多氯联苯、邻苯二甲酸醋等有 机污染物等有机污染物。滨海生态系统中的氮素富集，常常蕴含着过量的高浓度氨氮和亚 硝酸氮的积累，从而会对海洋生物产生直接的毒害作用，降低其免疫力，引发病原生物入侵 从而造成，而好养反硝化功能菌介导的反硝化作用可W有效地缓解运一现象（Camargoand Alonso, 2006)。好氧反硝化菌（AerobicDenitrifier)是一类能够在有氧条件下，利用好 氧反硝化酶进行反硝化作用的反硝化菌，在运个过程中通过它能够使硝酸盐（N03)逐步转 变为亚硝酸盐（N02)、一氧化二氮（成0)和氮气（成)，从而达到脱氮的目的。水体脱氮最有 效且环保的方法即采用硝化反硝化微生物进行水体修复，且具有高效、价格低廉、安全性较 高等特点。目前已有报道的好氧反硝化菌主要包括假单胞菌属（Pseudomonas)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)、副球菌属（Paracoccus)和芽抱杆菌属度acillus)等，属好氧或兼性好氧 异养微生物，而关于海杆菌的报道较少化ietal.，2013)。
[0003] 有机污染物多环芳控具有致癌、致崎、致突变性、半挥发性、亲脂性、高生物蓄积性 和难降解等特性，其能够在环境中长时间存在、长距离迁移并富集于生物体，给人类健康和 生态系统安全造成长期而严重的危害，而在海洋湿地环境中的多环芳控除较少部分通过光 化学分解外，大多数还是依赖于生物降解的途径进行消除，微生物降解是一条高效途径。已 有研究表明海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)在高达20%的盐浓度下仍能 降解控类，具有更为广泛的应用性。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种同时具有反硝化和有机物多环芳控降解功能 的除巧海杆菌（Marinobacterhy化oca;rbonoclasticus)STW2,该菌于 2014 年 7 月 10 号 保藏于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCN0:M 2014339。
[0005] 本发明的除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2具有反硝化 和有机物多环芳控降解功能。
[0006] 因此本发明的第二个目的是提供除控海杆菌（Marinobacter hy化ocarbonoclasticus)STW2在通过反硝化进行脱氮中的应用或者在降解多环芳控有机 物中的应用。
[0007] 本发明的除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2具有反硝化 和有机物多环芳控降解功能，因此可w将其应用于反硝化进行脱氮中w及降解多环芳控有 机物，从而能够有效应用于海洋滨海湿地生态系统的修复和保护中，具有较好的应用前景。
[0008]除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 于 2014 年 7 月 10 号保藏于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCN0:M 2014339。
【附图说明】：
[0009]图 1 是除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 的 16SrDNA的 系统进化发育树，图中的51胖2表示除控海杆菌（祀117化〇〇日计〇11〇(31日3^(3113化1胖2;
[0010] 图2是除控海杆菌STW2的nosZ的系统进化发育树，图中的STW2表示除控海杆菌 (M.hydroc曰rbonocl曰sticus)STW2。
[0011] 图3是好氧条件下除控海杆菌STW2的反硝化效率测定。
【具体实施方式】：
[0012] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 阳〇1；3]实施例1 :除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2的分离和纯 化.
[0014] 样品采集：2012年4月于中国海南省新村湾海草生态系统海富蒲巧nhalus acodoides)根际沉积物，取Ig沉积物样品于装有100血无机盐培养基并含有一定量 PAHs(糞、巧和巧各含量为lOOmg/L)的S角瓶中，W多环芳控（奈、巧和巧）为唯一碳源，采 用定向富集法、逐级驯化获得菌株，用锡锥纸包裹遮光置于摇床中30°C，200rpm震荡培养， 然后进一步通过反硝化培养基培养进行筛选、分离和纯化，最终筛选出一株具有兼具有好 氧反硝化和多环芳控降解能力的菌株，命名为：菌株STW2。
[0015]反硝化培养基：pH:7. 0，含KN032.Og，M拆〇4. 7&0 0.诚，K2HPO4.抓2〇 0.5邑， 〔4〇班2謂曰20.0g，去离子水1L。灭菌消毒备用。
[0016] 无机盐培养基（MSM)的组分为：(NH4)2S04,l，000mg/L、Na2HP〇4,800mg/ L、KH2PO4, 200mg/L、M拆O4? 7&0, 200mg/L、Ca(N〇3)2? 4&0, 50mg/L;其中微量元素： FeCls? 3电0, 5mg/L、（NH4)gM〇7〇24 ? 4电0,Img/L、MnClz, 0. 2mg/L、CuS〇4, 0. 02mg/L、 CoCl2,〇. 02mg/L。灭菌消毒备用
[0017]实施例 2 :除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 的鉴定 阳〇1引1、形态学特征：
[0019] 菌株STW2,为革兰氏阴性，杆状，在LB或2216E培养基上，菌落均呈灰白色，不透 明，表面光滑湿润，边缘比较规则，中央微凸起，菌落形态大小l-3mm，化C1的生长范围为 0-22%，最适浓度为5%，能够进行硝酸盐还原，利用屯叶巧、葡萄糖、麦芽糖和木糖。
[0020] 2、16SrDNA和功能基因序列鉴定：
[0021] 选择实施例1分离纯化得到的菌株STW2进行基因组DNA提取和纯化，其操作方法 参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》?4。9。采用细菌的通用引物16SF/16SR(Weisenburget 曰1., 1991，16Sribosom曰1DNAamplificationforphylogeneticstudy.Journalofb曰c teriology, 1991, 173(2):697_703)和nosZ的引物巧ichJ,etal.Communitycomposition andfunctioningofdenitrifyingbacteriafromadjacentmeadowandforestsoils. AppliedandElnvironmentalMicrobiology, 2003, 69 (10): 5974-5982.)作为引物，W菌株STW2基因组DM作为模板，进行16SrDNA的PCR扩增，具体的PCR反应体系如下：16SrDNA PCR扩增程序如下：94°C预变性5min;94°C变性60sec，退火溫度55°C复性90sec，72°C延伸 60sec，进行35个循环后；72°C延伸lOmin;nosZ的PCR程序为95°C预变性5min;95°C变性 30sec，退火溫度55°C复性40sec，72°C延伸40sec，进行40个循环后；72°C延伸lOmin。取 5yL的扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为1 %，邸泡胶，用凝胶成像系统观察 泳结果并拍照，若有目的条带的出现，则将剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术 有限公司用ABIPrism3730化DNA分析系统测序，并将测序分析得到的16SrDNA(其核巧 酸序列如SEQIDNO. 1所示）和一氧化氮还原酶nosZ(其核巧酸序列如SEQIDNO. 2所 不）通过ExtaxonCloud或者GenBank中的BLAST与GenBank数据库中的序列进行比对， 对其种属鉴定进行初步的确定。建立系统发育树，系统发育树如图1，从图1的系统发育树 可W看出与菌株STW2的16SrDNA序列具有较近亲缘关系的序列均来自Marinobacter属， 其与Marinobacterhy化ocarbonoclasticusATCC49840 的相似度为 97. 70%;图 2 中菌株 STW2的nosZ基因与NCBI数据库中的海杆菌M.pelagiusR42的相似度为85%。由此表明菌 株STW2的为一株潜在新种，命名为：除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus) STW2,于2014年7月10号保藏于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，中国武汉武汉大学，保 藏编号为CCTCCNO:M2014339。 阳02引实施例3 :菌株STW2的反硝化功能效率测定
[0023]将待测菌株-除控海杆菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 接种 到反硝化液体培养基中，于30°C，18化pm过夜培养，待菌液浑浊后取适量分别接种到24 个含有60mL反硝化液体培养基的lOOmL锥形瓶中，并保证每个瓶中的初始接种量是相同 的。分别在Oh、化、1化、24h、3化、4化、6化和72h(每个时间点3个重复），取出上清液，测 定其N03-N和N02-N的含量（N03-N采用GB7480-87酪二横酸紫外分光光度法（Gi虹inget al.，2010) ;N02-N采用GB7493-87N-(1-糞基）-乙二胺分光光度法（Fanetal.，2006)，功 能菌株的反硝化速率的计算公式如下：
[0024]反硝化液体培养基：pH:7. 0,含KN032.Og，M拆〇4. 7&0 0. 2g，K2HPO4. 3&0 0.5邑， C^eHsKNa20.Og，去离子水1L。灭菌消毒备用。
[002引反硝化速率（mg?L1 ?h1)=(阳03-闲initial-阳03-闲final-阳02-闲final)/t.
[0026]其中：[NO3-闲initial:反应前硝态氮浓度； 阳027] 阳〇3_闲final;反应后硝态氮浓度；
[0028] 阳〇2-闲final:反应后硝态氮浓度.
[0029] 结果如图3所示，从图3中可W看出，在前24h内，硝酸盐浓度由145mg/L降至 58mg/l，脱氮效率高达为60 %，而4化内，脱氮效率高达74 %，整个反应过程中，脱氮效率约 为86%，而且在整个反应过程中没有亚硝酸盐的积累，因而没有氮素富集效应，对于环境中 的其他生物不会产生毒害效应，具有生态修复的巨大潜力。
【主权项】
1.除径海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2,其保藏编号为CCTCC NO :M 2014339。2.权利要求1所述的除径海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2在通 过反硝化进行脱氮中的应用或者在降解多环芳烃有机物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有反硝化功能的除烃海杆菌STW2及其应用。除烃海杆菌(Marinobacter？hydrocarbonoclasticus)STW2，其保藏编号为CCTCC？NO：M？2014339。本发明的除烃海杆菌(Marinobacter？hydrocarbonoclasticus)STW2具有反硝化和有机物多环芳烃降解功能，因此可以将其应用于反硝化进行脱氮中以及降解多环芳烃有机物，从而能够有效应用于海洋滨海湿地生态系统的修复和保护中，具有较好的应用前景。CCTCC NO：M 201433920140710
【IPC分类】C12N1/20, C02F3/34, C02F101/32, C12R1/01
【公开号】CN105199994
【申请号】CN201510703056
【发明人】凌娟, 董俊德, 张燕英, 杨清松, 林丽云, 曾思泉, 周卫国
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月23日