一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物防治领域，具体设及一种用于防治棉花立枯病的枯草芽抱杆 菌，W及含有该枯草芽抱杆菌的微生物菌剂，还设及它们在防治棉花立枯病上的应用。
【背景技术】
[0002] 棉花立枯病是一种由立枯丝核菌烟lizoctonia solani肺hn)引起的棉花苗期病 害，严重影响棉花的正常生长。低溫多雨年份棉花立枯病发生尤为严重。
[0003] 棉花立枯病的防治W化学药剂拌种或包衣防治为主，但防效欠佳，而且由于存在 环境污染问题不符合农业生态可持续发展的需要。目前，也未发现抗立枯病的棉花品种，抗 病育种的可行性也很小。因此，生产上仍缺乏有效、环保的防治措施。生物防治方法由于具 有对人畜无害、环境污染小、专化性强、持效期长和不易产生抗药性等优点，日益受到人们 的青睐。而筛选有效生防微生物是开发微生物源农药的基础。
[0004] 芽抱杆菌度acillius SP)是一种受到广泛关注的生防细菌。W其分布广、易分 离培养、能产生抗逆性较强的芽胞、胆藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微生 物。因芽抱杆菌能产生内生芽胞，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于 菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽 抱杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。 阳〇化]目前，用于防治作物立枯病的芽抱杆菌的专利主要有：解淀粉芽抱杆菌SZ-60 (【申请号】2014100170816)、枯草芽抱杆菌G68 (申请号为：2014102479010)、枯草芽抱杆 菌DPPG-26 (【申请号】2014103868726)、萎缩芽抱杆菌DPPG-28 (2014104612134)、多粘类芽 抱杆菌HY96-2 (专利号：021510199)、枯草芽抱杆菌HL259 (专利号：2005101048723)、枯草 芽抱杆菌B579 (专利号：2008101531801)、枯草芽抱杆菌NJN43 (专利号：2009101833581)、 枯草芽抱杆菌NB12(专利号：2011104234353)和巨大芽抱杆菌SJ-7(专利号： 2013102557034)等。由于病原菌的复杂性和同步进化，需要不断寻找新的抗病菌株。
[0006] 经检索，没有发现本发明枯草芽抱杆菌菌株HMB27703在防治棉花立枯病方面的 报道。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一种用于防治棉花立枯病的枯草芽抱杆菌菌株，该菌株具有 高效、杀菌谱广等优点。
[0008] 本发明另一目的在于提供一种利用上述枯草芽抱杆菌生产的微生物菌剂。
[0009] 本发明第=目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
[0010] 本发明第四目的在于提供上述枯草芽抱杆菌菌株在防治棉花立枯病、番茄灰霉病 或棉花枯萎病上的用途。
[0011]本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花 枯萎病上的用途。
[0012] 本发明第六目的在于提供上述枯草芽抱杆菌菌株的鉴定方法。
[0013] 本发明第屯目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。
[0014] 本发明通过W下技术方案实现：
[0015] 一种枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)菌株HMB27703,己于2015年9月29日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（保藏地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo. 11458。
[0016] 利用上述枯草芽抱杆菌HMB27703生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽抱杆 菌HMB27703菌体。
[0017] 上述微生物菌剂可W为液体制剂或粉剂。
[0018] 上述微生物菌剂，其HMB27703的活菌数大于15. 0X108c化/mL。
[0019] 上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0020] (1)菌种活化：将低溫保存的HMB27703菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落 在LB斜面培养基上，在25~35°C下培养10~16小时，得活化的菌株；
[0021] (2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤（1)活化的菌株接种到lOOmLLB 液体培养基中，在25~35°C、摇床转速为150~22化pm条件下培养10~16小时，得种子 液； 阳0巧 做发酵培养：按照体积比为1~3%的比例将步骤似的种子液接入到玉米粉黄 豆粉培养基中，在溫度为25~35°C、摇床转速为150~22化pm条件下发酵培养40~50h， 得发酵液；
[0023] (4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的 90%时停止发酵培养；所得即为丽827703菌株的液体制剂。
[0024] 所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。
[00巧]上述制备方法步骤（1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基，其组成成分及 其重量比为：膜蛋白腺8~12g，酵母提取物4~6g，氯化钢4~6g，琼脂粉12~18g，水 1000血D
[00%] 上述制备方法步骤（2)中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：膜蛋 白腺8~12g，酵母提取物4~6g，氯化钢4~6g，水1000血。
[0027] 上述制备方法步骤（3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分 比为：玉米粉 1.0 ~3. 0%，黄豆粉 1.0 ~3. 0%，NaCl0. 1 ~0.8%，MnS〇4*H2〇 0. 5 ~ 1.0%，其余为水；抑值为7.0。
[0028] 所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，包括按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、 化C1和MnS〇4 ? &0混合，再加水，调节抑揽拌均匀即可。
[0029] 所述的枯草芽抱杆菌HMB27703在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上 的应用。
[0030] 上述微生物菌剂在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的应用。
[0031] 上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为 10 7c化/mU于播种前将棉花种子浸种半小时；或将上述所得微生物菌剂用碳酸巧吸附，制 作成枯草芽抱杆菌HMB27703粉剂，于棉花播种前按照药种比1 :10拌种，均可达到预防棉花 立枯病发生的目的。
[0032]HMB27703菌株的筛选分离过程
[0033]HMB27703菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市农科院棉田 ±壤中分离得到。2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市农科院 棉田中采集上样，带回实验室后称取Ig上样放到250血的灭菌S角瓶中，加入100血无菌 水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置化，取上清液10血加入50血灭菌离屯、管中，在 80°C恒溫水浴30分钟，然后取1血加无菌水9血，即成10血10 3倍±壤微生物悬液，继而将 ±壤悬液稀释成10 4、10 5、10 6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200yL涂于LB培养基平板 上，每个浓度重复3次，在30°C恒溫培养ld-3d，进行细菌的分离和纯化。并W棉花立枯病 为祀标，通过平板对時法、盆栽试验法和田间小区试验进行生防菌的筛选。结果从中筛选出 一个对棉花立枯病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB27703。
[0034]HMB27703菌株的分类鉴定：
[0035] (1)形态特征鉴定
[0036] 在LB培养基上培养菌体为杆状，培养1化后产生芽胞，芽胞中生，楠圆形，胞囊不 膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡 乳白色，脈状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈慢头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘 不整齐，表面干燥有權皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培 养，表面形成白色菌膜。运些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著.科学 出版社.2001年）中描述的芽抱杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27703属于芽 抱杆菌属度acillus)。
[0037] 似利用16SrDNA序列鉴定分类
[0038]WHMB27703的基因组DNA为模板，WF27和R1492为引物对16SrDNA进行PCR 扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：
[0039]F27 :5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG3';(沈QIDNo: 1)，
[0040]R1492 :5'GGCTACCTTGTTACGACTT3';(SEQIDNo:2);
[0041] 16SrDNA的扩增反应体系为 50yL:10XPCRBuffer(Mg2+)5yL;dN