一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，设及杂交瘤细胞株2A1及其 分泌产生的抗万古霉素单克隆抗体，属于食品安全免疫检测领域。
【背景技术】
[0002]万古霉素（VAN)，英文名称为Vancomycin,是由McCormick等于1956年从一 株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsisorientalis)的发酵液中分离得到的一种糖肤类 抗生素，1958年11月份获美国抑A批准，由EliLilly公司开发上市，商品名为"稳可 信（Vancocin)"。盐酸万古霉素分子式为Ce化6化成〇24,CAS号为1404-90-6,分子量为 1485.71。国内由放线菌东方23号所产生的主要为去甲基万古霉素（NVAN)，英文名称为 Norvancomycin，于1967年投入临床使用。两者都是用于治疗由革兰氏阳性菌所引发的感 染性疾病。其作用机制是通过同时抑制细菌细胞壁生物合成中的两步酶促反应，即转糖基 作用(肤聚糖的延伸）和转肤作用(肤链的交联）或其中的任何一步，达到阻止细胞壁合成的 目的，从而导致细胞死亡。
[0003] 肾毒性和耳毒性是早前生产的不纯的万古霉素产生的副反应，运些副反应在50 年代中期进行的万古霉素临床试验中显得尤其严重。且万古霉素口服无法吸收，必须在 溶剂稀释的条件下缓慢给药，W避免局部疼痛和血栓静脉炎的发生，W及一些输液反应如 红人综合症。因此万古霉素仅作为保留药物治疗由少数金黄色葡萄球菌引起的严重感染 性疾病。但由于P-内酷胺类抗生素的大量使用，导致了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 (Methicillin-resistantStaphylococ州Saureus，MRSA)的产生，MRSA成为了地方性流 行性疾病，W及万古霉素纯化工艺的改善，使得万古霉素成为了治疗MRSA的特效药物。但 在1989年，美国首次报道了万古霉素耐药菌（Vancomycin-resistantenterococci,VRE)。 预防和控制万古霉素耐药菌的扩散需要各方面的协调努力。包括临床医生谨慎使用万古霉 素，及早的检测出具有耐药性的肠球菌及其他一些革兰氏阳性菌等。我国的兽药地方标准 废止目录中在禁用兽药一项中规定抗生素类药物万古霉素及其盐、醋及制剂不得检出。
[0004] 农业部1862号规定中利用液相色谱-串联质谱法测定饲料中的万古霉素。其他检 测方法还有固相萃取-高效液相色谱法（SPE-册LC)与巧光偏振免疫法（FPIA)相结合的方 法；反相高效液相色谱（RP-册LC)测定法；高效液相色谱法（HPLC)，但运些方法由于前处理 过程繁琐、耗时较长，要专口的仪器及耗材，费用较贵，并不适合临床应用。微生物分析方法 测定抗生素含量是一种经典的方法，样品无需作繁琐处理，且对仪器设备要求不高。但微生 物法测定易受合并应用其他抗生素的影响。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、 对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明在于提供一种能 产生对万古霉素具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为间接竞争 ELISA试剂盒W及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备 的抗体对万古霉素和去甲万古霉素具有较好的亲和力和检测灵敏度，可W用来建立万古霉 素和去甲万古霉素酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。
[0006] 本发明的技术方案：一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为2A1，已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCCNo. 10869。
[0007] 抗万古霉素单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo. 10869的杂交瘤细胞株 2A1所分泌产生。所述的抗万古霉素单克隆抗体的应用，其在食品中万古霉素和去甲万古霉 素残留量的分析检测中的应用。
[0008] 本发明提供的杂交瘤细胞株2A1细胞株的制备基本步骤为： (1) 免疫原的制备与鉴定：利用活泼醋法，使万古霉素盐酸盐的簇基与载体蛋白BSA的 氨基相连制备免疫原；利用高舰酸钢法，使万古霉素的葡萄糖基的邻二醇结构在高舰酸钢 的作用下氧化生成醒基，再与载体蛋白OVA的氨基反应生成Schiff氏碱W制备包被原，反 应结束后，通过透析分离完全抗原与未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描 方法鉴定； (2) 小鼠的免疫：将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。 首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一 次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为=周。第= 次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制，根据小鼠血清的检测结果，确定加强免疫的 次数； (3) 细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000)法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤 细胞融合，融合后细胞用HAT培养基培养，第S天进行HAT半换液，第五天HAT全换液，第屯 天取出细胞上清液利用间接化ISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争化ISA法测定 阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行=次亚克隆，最 终筛选获得稳定的杂交瘤细胞株2A1; (4) 杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定； ICs。值、交叉反应率及亲和力的测定通过化ISA法。
[0009] 本发明的有益效果在于：（1)本发明获得的抗万古霉素单克隆抗体细胞株，可W 达到同时检测万古霉素和去甲万古霉素的目的。（2)选择两种偶联方法合成了免疫原和包 被原，利用了万古霉素不同的连接位点，W达到更高的检测灵敏度。
[0010] 生物材料样品保藏：一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株2A1，分类命名为 单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，简称CGMCC，地 址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 10869,保藏日期2015年05月19日。
【附图说明】
[0011] 图1免疫原的紫外吸收光谱表征。
[0012] 图2包被原的紫外吸收光谱表征。
[0013] 图3杂交瘤细胞株2A1单克隆抗体对万古霉素和去甲万古霉素的标准曲线。
【具体实施方式】
[0014] 本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不作为本发明的限定内容 或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0015] 本发明通过将制备的万古霉素免疫原免疫小鼠，选择效价和抑制效果最好的小鼠 进行细胞融合，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，通过间接化ISA和间接竞争化ISA 筛选细胞上清，得到对万古霉素抑制效果最好的杂交瘤细胞孔，通过对该孔的细胞=次亚 克隆，最终得到了能分泌对万古霉素有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株。
[0016] 实施例1 :杂交瘤细胞株2A1的制备 1、完全抗原的合成 取7.Omg万古霉素盐酸盐，再加入2.OmgEDC和1.OmgN服，使用400yLDMF，200yL MES缓冲液溶解，室溫揽拌，活化4h;另取5mgBSA溶解于2血、0.05M、pH9.6的CB溶 液中，将上述活化后的万古霉素溶液慢速逐滴加入BSA溶液中，室溫揽拌反应过夜后，4°C 透析S天，-20°C分装保存得到免疫原。取5mg万古霉素盐酸盐溶于水中，加入新鲜配置的 2. 5mg化1〇4水溶液，冰浴活化30min，将上述活化后的万古霉素溶液慢速逐滴加入溶解于 2mL、0. 05M、pH9. 6 的CB溶液中的 5mgOVA溶液中，4°C