一种利用非特异性结合蛋白来提高基于pcr的基因合成技术灵敏度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明是设及一种基于PCR的基因合成技术为基础的核酸分子合成和扩增技术 的方法，主要设及一种耐热的，非特异性结合的蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏 度的方法。
【背景技术】
[0002] 重叠延伸PCR技术（genesplicingbyoverlapextensionPCR，简称S0EPCR)由 于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重 叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行 有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用运一技术很快获得其它依 靠限制性内切酶消化的方法难W得到的产物。重叠延伸PCR技术是根据目的基因的核巧酸 序列，将目的基因分成70~90bp不等的多条引物，分段进行合成，利用相连片段间20~ 30bp重叠的核巧酸部分互相搭桥、互为模板，通过几轮连续的PCR反应将各个片段组合成 为目的基因。
[0003] 来源于大肠杆菌菌株U93的组蛋白样蛋白（皿）是与DNA非特异结合的类似组蛋 白的耐热的小分子蛋白质。皿是由两个同源亚基化pA和化地组成，是最保守的核酸结合 蛋白，可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。皿蛋白 不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。皿蛋 白作为一种与DNA非特异性结合的蛋白，在细菌染色体的压缩和排列过程中扮演了重要角 色。它除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，还能对DNA的结构起到一些特殊作用，如DNA 的弯曲、基因转录调控、起始于复制原点的复制、核蛋白复合物在装配时所需的位点特异性 重组反应，W及通过蛋白质-RNA相互作用控制的翻译起始等。
[0004] 在PCR反应中，反应液的组成及热循环反应条件的优化是决定反应成败的关键， 对于重叠延伸PCR反应而言更是如此。为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸PCR反 应一般采用高保真DNA聚合酶。传统的高保真DNA聚合酶虽具有较好的校正能力，但其扩 增效率一直难W令人满意。虽然一些既具有校正功能又具有很强延伸能力的DNA聚合酶已 陆续被开发应用，但是效果也仍需加强。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成 技术灵敏度的方法，并且能够有效地提高合成和扩增目标核酸序列的灵敏度。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通过 如下步骤实现：
[0008]S1 :设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核巧酸；其中，每个序列都有25bp 的重叠寡核巧酸，W覆盖整个DM序列（200到1500碱基）；
[0009]S2 :将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作为模板的上述混 合重叠寡核巧酸的反应液中加入皿蛋白原液；其中，皿蛋白原液的浓度为13化g/y1。
[0010]S3:按照常规PCR的解链，退火，延伸S个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段 合成并且扩增。
[0011] 采用上述方案后，本发明中将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W 及作为模板的混合重叠寡核巧酸的反应液中加入非特异性结合蛋白皿蛋白，按照常规PCR 的解链，退火，延伸=个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。本发明 方法能够特异性地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
【附图说明】
[001引 图1是皿蛋白活性电泳检测图（环状的双链DNA作为底物）；
[001引图2是皿蛋白活性电泳检测图（双链线性DNA作为底物）；
[0014] 图3是皿蛋白活性电泳检测图（单链线性DNA作为底物）；
[0015] 图4A是非特异性结合蛋白对皿-P蛋白基因合成影响的电泳检测图；
[0016] 图4B是非特异性结合蛋白对Pro-Tgase蛋白基因合成影响的电泳检测图；
[0017] 图5中皿蛋白SDS-PAGE电泳检测图。
【具体实施方式】
[0018] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0019] 本发明一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方 法，通过如下步骤实现：
[0020] S1 :设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核巧酸；其中，每个序列都有25bp 的重叠寡核巧酸，W覆盖整个DM序列（200到1500碱基）；
[002。S2 :将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作为模板的上述混 合重叠寡核巧酸的反应液中加入皿蛋白原液；其中，皿蛋白原液的浓度为13化g/y1。
[0022] S3 :按照常规PCR的解链，退火，延伸S个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段 合成并且扩增。
[0023] 上述混合重叠寡核巧酸（所有的重叠寡核巧酸链）由LifeTechnologies公司合 成。
[0024] -、皿-P蛋白的活性检测
[002引 （1)将不同浓度的皿-P蛋白加入到相同量的祀T-2化质粒中，室溫下静置lOmin后用1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，pET-2化质 粒的条带发生了明显的移动，结果如图1所示。图1中：
[0026]M:DNA分子量Marker;
[0027] 1:质粒狂）与shiftbuffer(SB)混合液；
[002引 2 :Z与SB混合液体系内加入稀释5倍的0. 2y1皿；
[0029] 3 :Z与SB混合液体系内加入稀释5倍的2y1皿；
[0030] 4 :Z与SB混合液体系内加入1y1皿；
[0031] 5 :Z与SB混合液体系内加入1. 8y1皿；
[003引 6:Z与SB混合液体系内加入2y1皿；
[003引 7 :Z与SB混合液体系内加入2. 5y1皿；
[0034] 8 :Z与SB混合液体系内加入3y1皿；
[003引 9 :Z与SB混合液体系内加入3. 5y1皿；
[003引 10 :Z与SB混合液体系内加入4y1皿；
[0037] 11 :Z与SB混合液体系内加入4. 5y1皿；
[003引 12 :Z与SB混合液体系内加入5y1皿。
[00測 似将不同浓度的皿-0蛋白加入到相同量的线性双链DNAOm-b的PCR产物） 中，室溫下静置lOmin后用2% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓 度蛋白后，线性双链DNA的条带发生了明显的移动，结果如图2所示。图2中：
[0040]M:DNA分子量Marker;
[0041] 1:PCR的DM产物（P)与shiftbuffer(SB)混合液；
[004引 2 :P与SB混合液体系内加入1y1皿蛋白原液；
[004引 3 :P与SB混合液体系内加入2y1皿；
[0044] 4 :P与SB混合液体系内加入3y1皿；
[004引 5 :P与SB混合液体系内加入4. 5y1皿；
[004引 6 :P与SB混合液体系内加入5. 5y1皿；
[0047] 7 :P与SB混合液体系内加入6. 5y1皿；
[004引 8 :P与SB混合液体系内加入8y1皿；
[0049] 9 :P与SB混合液体系内加入9y1皿。
[0050] 做将不同浓度的皿-0蛋白加入到相同量的线性单链DNA(单链引物）中，室溫 下静置lOmin后用3% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白 后，线性单链DNA的条带发生了明显的移动，结果如图3所示。图3中：
[0051]M:DNA分子量Marker;
[0052] 1 :01igo6f5bp(0)与shiftbuffer(SB)混合液；
[005引 2 :0与SB混合液体系内加入1y1皿蛋白原液；
[0054] 3 :0与SB混合液体系内加入2y1皿；
[005引 4 :0与SB混合液体系内加入3y1皿；
[005引 5 :0与SB混合液体系内加入4. 5y1皿；
[0057] 6 :0与SB混合液体系内加入5. 5y1皿；
[005引 7 :0与SB混合液体系内加入6. 5y1皿；
[0059] 8 :0与SB混合液体系内加入8y1皿；
[0060] 9 :0与SB混合液体系内加入9y1皿；
[006U10 :0与SB混合液体系内加入9. 5y1皿。
[006引二、在基于PCR的基因合成体系中加入皿蛋白
[0063]为了探索皿-P对基于PCR的基因合成效率的影响，我们使用PCR对皿-P蛋白 基因和Pro-Tgase蛋白基因进行合成，在分别加入了不同浓度的皿-P蛋白后，合成产物经 1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了皿-P蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与 没加的相比有如下变化：在一定浓度的皿-p蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到 一定值后合成效率反而变小，结果见图4A、图4B所示。
[0064]图 4A中：
[0065]M:DNA分子量Marker;
[0066] 1:皿-P蛋白基因的PCR合成体系做的结果检测
[0067] 2 :H体系中加入0. 5y1皿蛋白原液；
[006引 3 :H体系中加入1y1皿蛋白原液；
[0069] 4 :H体系中加入2y1皿蛋白原液；
[0070] 5 :H体系中加入4yl皿蛋白原液。