一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物及其筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种贝类线粒体cox2 [细胞色素c氧化酶亚基II (cytochrome coxidase subunit II)]基因扩增引物的筛选方法，特别是涉及一种北方常见経类线粒体cox2基因扩增引物的筛选方法。
【背景技术】
[0002]経类隶属软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，异齿亚纲(Heterodonta)，帘蛤目(Veneroida)，生活于潮间带至水深400m左右的海域，其肉味鲜美，具有较高的食用价值。特别是大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏，在我国分布广泛，是重要的经济贝类。
[0003]近年来，由于过度采捕、海洋环境的日益恶化以及栖息地萎缩，蛏类的资源量逐年下降，急需加快对其多样性的评估，为种质资源的合理开发利用和保护奠定基础。线粒体脱氧核糖核酸(Mitochondrial DNA,即mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中性进化等特性，在群体遗传多样性、物种鉴定、系统发生学等领域中发挥着重要作用。随着技术和方法的不断进步以及测序成本的减少，在过去十年里，测定的mtDNA数量明显增长。mtDNA的获得主要采用步移法与鸟枪法，其中步移法成本低，操作简单，最为常用。步移法使用Long-PCR技术，Long-PCR引物的设计依赖于线粒体基因组短片段序列的获得。得到的短片段序列越多，越有助于得到基因组全长。目前大竹蛏、长竹蛏、缢蛏的mtDNA已经测定完成，小刀蛏的mtDNA序列还未见报道。在采用步移法测定小刀経的mtDNA过程中，利用coxl基因与16S rRNA基因的短片段设计的Long-PCR引物有一对没有扩增成功，阻碍了全长的获得，必须得到其它的短片段序列。由于cox2基因没有通用引物，开发适用性好的cox2基因扩增引物可加快线粒体基因组的测序进展，有助于蛏类的多样性评估、种质资源保护与利用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物的筛选方法，它能满足现有技术的上述需求。
[0005]—种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox2序列山、将下载的序列用B1Edit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，送交送交有合成能力的机构合成；d、将大竹経、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体提取DNA，然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物 cox2CF 和 cox2CR:cox2CF 为 5’ AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3’ ； cox2CR 为 5’GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3，。
[0006]本发明筛选出一对用于扩增北方常见蛏类线粒体部分cox2序列的引物cox2CF和cox2CR，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，有助于快速获得线粒体基因组全长，满足蛏类遗传多样性、系统发生学研究的需要。
【具体实施方式】
[0007]实施本发明的北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物的筛选方法时，分以下五步:
a、登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),下载已有的大竹経、长竹経、溢経线粒体全序列中的cox2序列(Genbank登录号为:HQ703012、JN786377 和 JN398366)。
[0008]b、用序列处理软件 B1Edit (http://www.mb1.ncsu.edu/B1Edit/b1edit.html)对上述序列进行多重比对分析，确定出前后端较保守区域。
[0009]C、经比对后在前后端各100个碱基对的较保守区域内，用引物设计软件PrimerPremier 5 (http://www.premierb1soft.com/primerdesign/index.html)设计弓丨物，设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。设计的多对引物交由上海生工生物技术有限公司合成。
[0010]d、对采自山东沿海的大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体用苯酚-氯仿法提取DNA，加双蒸水稀释为100 ng/μ?的工作液备用。
[0011]e、在10 μ I PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这些个体的cox2片段，该体系包括:100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+plus)，0.2mM dNTPs，引物各 I μ M。PCR扩增条件为:94 °C预变性 3 min，94 °C变性 45s，46-54 °CiI火45s，72 °C延伸45s，共35个循环，最后72 °C延伸5 min。
[0012]本实验扩增出的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一，扩增效率高的一对引物 cox2CF (5，AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3，)和 cox2CR (5，GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3’):该引物的最佳退火温度为50°C，产物片段长度约570bp。
【主权项】
1.一种北方常见蛏类线粒体C0X2基因扩增引物，其特征是该引物为一对，引物条带单一、扩增效率高，分别是 cox2CF 和 cox2CR:cox2CF 为 5’ AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3’ ；cox2CR 为 5， GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3，。2.根据权利要求1所述的一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物，其特征是引物的最佳退火温度为50°C，产物片段长度约570bp。3.权利要求1所述的一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物的筛选方法，包含以下步骤: a、下载序列:登陆美国国立生物技术信息中心，下载大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox2序列； b、序列比对:将下载的序列用B1Edit软件比对分析，确定序列两端保守区域； C、引物设计与合成:在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，送交有合成能力的机构合成； d、DNA提取:对采集的大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体提取DNA，加双蒸水稀释为.100 ng/ μ I的工作液备用； e、引物扩增:然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况:在10 μ I PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这些个体的cox2片段，该反应体系包括 100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+ plus),.0.2 mM dNTPs，引物各 I μ M ;PCR 扩增条件为:94 °C预变性 3 min，94 °C变性 45s，46-54°C退火45s，72 °C延伸45s，共35个循环，最后72 °C延伸5 min。
【专利摘要】本发明涉及一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物及其筛选方法，分为五步：a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox2序列；b、将下载的序列用软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件设计多对引物，送交上海生工生物技术有限公司合成；d、将大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体提取DNA，然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物cox2CF和cox2CR。本发明筛选出一对引物具有条带单一、扩增效率高的特点，有助于快速获得线粒体基因组全长，满足蛏类遗传多样性、系统发生学研究的需要。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/11
【公开号】CN105200046
【申请号】CN201510612109
【发明人】冯艳微, 刘相全, 韦秀梅, 姜绪, 王卫军
【申请人】山东省海洋资源与环境研究院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日