缺刻缘绿藻δ6 fad基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地说，设及一种缺刻缘绿藻A6FAD基因启动子及 其应用。
【背景技术】
[0002] 花生四締酸（arachidonicacid，ArA，20:4?6)是人类营养的一种必需脂肪酸。不 仅具有许多生理学及药理学活性，而且是人脑膜憐脂的主要成分。它在细胞内发挥第二信 使作用，参与造血免疫调节，引起血管舒张，参与肝、胆等器官多种功能的调节，是内循环系 统和中枢神经系统中起重要作用的前列腺素和白介=締的前体。ArA还是成熟母乳的一种 重要成分，对产后婴儿的视力和智力发育都是必需的。因此，FA0/WK)推荐在婴儿奶粉中添 加ArA。缺刻缘绿藻（Myrmeciaincisa)富含大量的ArA，尤其是在胁迫环境（如憐饥饿、 氮饥饿）下，ArA最高含量可达到藻体干重的7%，是目前ArA含量较高的藻种，具有潜在的 开发利用价值。
[0003] ArA是一种多不饱和脂肪酸（PUFA)。生物体中的PUFA合成主要有两种途径，即 ?-6途径和0-3途径。ArA是沿着0-6途径合成的：即亚油酸首先在A6脂肪酸去饱 和酶（FAD)的去饱和作用下生成丫-亚麻酸，之后由A6脂肪酸延长酶（FAE)延长生成双 高-丫 -亚麻酸（dihomo-丫-linolenicacid，20:3&s'ii'i4,DGLA)，再由A5FAD的去饱和作 用生成ArA。研究还发现，亚油酸在A15FAD的作用下可生成a-亚麻酸（ALA)进入0-3 途径，然后，ALA可在A6FAD作用下去饱和为十八碳四締酸（stearidonicacid，SDA， 18:4&6'9'12'1 5)，并通过脂肪酸去饱和与延长作用，进一步产生二十碳五締酸巧PA)和二十二 碳六締酸值HA)。Tocher和Harvie的研究指明，0-6和0-3合成途径的第一步催化脱氨 反应是限速步骤，在《-6途径中，运一步骤是由A6FAD起催化作用的。通过对缺刻缘绿 藻A6FAD作底物偏好性分析，发现A6FAD不仅可W使LA变成GLA，也可W将ALA催化成 SDA，但产物的效率都不高，从而也说明了A6FAD的限速作用。显然，A6FAD基因的转录 量越大就越有利于ArA的产生。
[0004] 众所周知，基因的转录一般受控于该基因上游5' -侧翼序列的启动子。启动子序 列常常含有调控元件，使该基因的转录对变化的环境产生应答，从而表现出差异性表达。因 此，为了深入探讨缺刻缘绿藻在氮等逆境条件下累积ArA的机理，有必要了解该藻A6FAD 基因的启动子及其功能。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的多核巧酸。
[0006] 本发明的再一的目的是，提供所述的多核巧酸的用途。
[0007] 本发明的另一的目的是，提供一种重组载体。
[0008] 本发明的第四个目的是，提供一种遗传工程化的宿主细胞。
[0009] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0010] 一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸选自下列中的一种：
[0011] a)沈QIDNO. 4的第383bp至第2347bp处所示的核巧酸序列；或
[0012] b)与a)中所限定的核巧酸序列互补的核巧酸序列。
[0013] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0014] 如上所述的多核巧酸用于作为启动子元件的用途。
[0015] 所述的启动子元件用于指导目的基因表达。
[0016] 所述的目的基因来自于藻类。
[0017] 为实现上述第=个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] 一种重组载体，所述的重组载体含有如上所述的多核巧酸，作为启动子元件。
[0019] 所述的重组载体还含有与所述多核巧酸可操作地连接的目的基因。
[0020] 所述的目的基因位于所述多核巧酸的下游。
[0021] 所述的重组载体是真核表达载体。
[0022] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0023] 一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞：
[0024]a)含有如上任一所述的重组载体；或
[00巧]b)其基因组中整合有外源的如上所述的多核巧酸。 阳0%] 所述的宿主细胞是真菌。
[0027] 本发明优点在于：
[0028] 本发明基于发明人的长期研究经验，根据已克隆到的缺刻缘绿藻A6FAD基因 cDNA全长序列（登录号为JN205755)设计引物，利用基因组步移（genomewa化ing)试剂 盒自缺刻缘绿藻的基因组DM中扩增到A6FAD基因上游长为2347bp的5'-侧翼序列。 在生物信息学分析的基础上，结合发明人丰富的启动子分析和预测经验，将其中长1965bp 的片段连入切除T7启动子且插入绿色巧光蛋白（GF巧基因的PYES2载体中，然后转入尿喀 晚合成缺陷型的酿酒酵母BY4741中。诱导表达后，利用激光共聚焦显微镜（Con化cal)观 察转基因酵母的结果表明，转入的长1965bp序列可W启动位于其下游的GFP基因表达。巧 光强度分析的结果显示，它与T7启动子具有相似的启动效率。本研究结果表明所转入的长 1965bp序列为缺刻缘绿藻A6FAD基因的启动子，且可W高强度地启动目的基因的大量表 达，为人为调控藻类去饱和酶等基因的表达创造了条件。
【附图说明】
[0029] 附图1是基因步移S轮PCR扩增产物电泳图。泳道Ml和M2:分别为D2000和Maker IV分子量标准；第1、2、3泳道分别对应于A6FAD基因上游5'-侧翼序列片段的第1、2、3 轮PCR扩增产物。
[0030] 附图2是PMD19-T载体图谱。
[0031] 附图3是A6FAD基因上游长1965bp的5' -侧翼序列W及所预测的调控元件。
[0032] 附图4是PCAMBIA1304双元表达载体图谱。
[0033] 附图5是PYES2载体图谱。
[0034] 附图6是转化了pY-DT7-1965-GFP、pY-DT7-GFP和pY-GFP酿酒酵母细胞的激光共 聚焦显微镜图谱。其中，Y-DT7-GFP转基因酵母为阴性对照组，Y-GFP转基因酵母为阳性对 照组；GFP为485nm激发光下摄取的绿色巧光蛋白信号图。图中的标尺为5ym大小。
[0035] 附图7是转基因酵母巧光强度的比较。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。 阳〇37] 实施例1
[0038] 本发明所采用的主要操作包括：
[0039] (1)将缺刻缘绿藻接种于BG-11培养基的S角锥形瓶中，置于溫度为25°C、光照强 度为115ymolphotonsm2s\光照周期为光照：黑暗/I化：1化的培养箱中培养，每天定 期摇晃数次。收集藻体细胞，并提取基因组总DNA。
[0040] (2)根据缺刻缘绿藻A6FAD基因cDNA全长序列（登录号为JN205755)设计基因 特异引物（GSP1 :沈QIDNO. 1 ;GSP2 :沈QIDNO. 2 ;GSP3 :沈QIDNO. 3)，通过基因组步移 技术克隆出A6FAD基因上游的5'-侧翼序列（SEQIDNO. 4)，再通过网络服务器进行启 动子序列的调控元件在线预测。
[0041] (3)根据已获得的A6FAD基因上游5' -侧翼序列并结合启动子序列分析结果 设计带KpnI/BamHI酶切位点引物（SEQIDNO. 5和沈QIDNO. 6,其中沈QIDNO. 5的第 l-6bp为化nl酶切位点，SEQIDNO. 6的第l-6bp为BamHI酶切位点），利用PCR反应把 A6FAD基因上游5'-侧翼序列长1965bp的片段亚克隆到PMD19-T载体中，得到重组质粒 PMD19T-1965。基于PCAMBIA1304双元表达载体中GFP基因的编码序列设计带BamHI/EcoRI 酶切位点引物（SEQIDNO. 7和沈QIDNO. 8,其中沈QIDNO. 7的第l-6bp为BamHI酶切 位点，SEQIDNO. 8的第l-6bp为EcoRI酶切位点