一种meso-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因、重组酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种来源于地衣芽抱杆菌度acillus licheniformis)CICIMB0109的mes〇-2,3-下二醇脱氨酶及其基因，W及含有该基因的重 组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，W及该还原酶或其重组 酶作为催化剂在不对称还原前手性双幾基化合物W制备光学活性手性醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 手性二醇因具有两个手性中屯、成为一种非常重要的手性化合物，它是合成精细化 学品、手性药物、手性试剂等的手性搁块。其中，（2S，3巧-2, 3-下二醇在不对称合成含两个 邻位手性中屯、的手性化合物中起重要作用。
[0003] meso-2, 3-下二醇脱氨酶属于短链脱氨酶（Sho;rt-chaindehy化ogenase/ re化ctase)家族，其催化的不对称还原反应需要依赖于辅酶NAD(P)\许多微生物中 含有meso-2, 3-下二醇脱氨酶，如粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens)、红平红球菌 巧hodococcuser}ftbopolis)、克雷伯氏肺炎菌化lebsiellapneumonia)、阴沟肠杆菌 巧nterobactercloacae)等。运类meso-2,3-下二醇脱氨酶具有将双乙酷还原生成单 一构型（2S，3S)-2, 3-下二醇的功能。采用发酵法生产2, 3-下二醇可达到较高水平（约 为150g?L1)，然而由于微生物野生菌中酶系复杂，运种方法生产的2, 3-下二醇一般至少 为两种构型的混合物，不是单一构型，达不到合成精细化学品或者药物的要求（Celinska E.,GrajekW.'Biotechnol.Adv. ,2009, 27, 715-725;QinJ.,etal.,畑in.J.Chem. 化g.，2006, 14, 132-136)。
[0004] 2001 年，Ui等将解糖短杆菌度revibacteriumsaccharol^ixum)中 (2S，3S)-2, 3-下二醇脱氨酶编码基因在E.coli中表达，W外消旋的乙偶因为底物，可生产 3. 7g/L(2S，3S)-2, 3-下二醇扣ietal.，Lett.Appl.Microbiol. ,2001，32, 93-98)。2004 年，化等将克雷伯氏肺炎菌化lebsiellapneumonia)中的meso-2,3-下二醇脱氨酶和 B.saccha;rol5fticum中的（2S, 3S)-2, 3-下二醇脱氨酶编码基因在E.coli中共表达，W双乙 酷为底物，可生产 2. 2g/L的（2S，3S)-2,3-下二醇（ee值为 96%)扣ietal.，Lett.Appl. Microbiol.，2004, 39, 533-537)。2010 年，Xiao等将枯草芽抱杆菌度acillussubtilis) 中的（2R, 3R)-2, 3-下二醇脱氨酶和短乳杆菌（Xactobacillusbrevis)中的NADH氧化酶 编码基因在6.(：〇11中表达，拆分2,3-下二醇混旋体，可生产（25,3巧-2,3-下二醇（66值 为99%)狂iaoZ.，etal.，PLoS0NE，2010,5，e8860)。2011年马翠卿等将来源于阴沟肠 杆菌巧nterobactercloacae)的（2S,3S)-2, 3-下二醇脱氨酶基因在大肠杆菌中表达， ^双乙酷和葡萄糖为底物转化生产（25,35)-2,3-下二醇，最高产量为26邑/1化11乂.，6* al.，Bioresour.Technol.，2012, 115, 111-116)。因此，利用立体选择性 2, 3-下二醇脱氨 酶，还原双乙酷为（2S，3S)-2, 3-下二醇，是合成单一构型（2S，3S)-2, 3-下二醇的一种重要 方法。然而目前的反应体系，脱氨酶催化活性不高，产物浓度较低，使上述方法具有一定局 限性，因此有必要寻找新的微生物来源立体选择性meso-2, 3-下二醇脱氨酶，W实现高纯 度（2S，3S)-2, 3-下二醇的高效合成。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是针对W野生地衣芽抱杆菌度acillus licheni化rmis)CICIMB0109整细胞作为双乙酷不对称还原催化剂时酶产量较低使总体催 化活性不高，不对称还原底物谱较窄的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、底物 适用性广、对环境友好的的meso-2, 3-下二醇脱氨酶及其编码基因，W及含有该基因的重 组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，W及该在制备（2S，3S)-2, 3-下二醇的 应用。 W06] 本发明的meso-2, 3-下二醇脱氨酶基因来源于地衣芽抱杆菌度aci1lus licheni化rmis)CICIMB0109,命名为B化化，其编码序列如沈QIDNO. 1所示；或编码由序 列表SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；W及任何对SEQIDNO. 1所示核巧酸序 列进行一个或多个核巧酸的取代、插入或缺失处理获得的核巧酸序列。基因全长为783bp， 其编码序列（CD巧从第1个碱基起至第780个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA，序列内无内含子。
[0007] 本发明的meso-2, 3-下二醇脱氨酶，命名为B1抓H，氨基酸序列为SEQIDNO. 2所 示；及任何对SEQIDNO. 2所示氨基酸序列中氨基酸进行插入、缺失或替换的处理获得的多 肤片段或其突变体。
[0008] 本发明进一步设及产所述meso-2, 3-下二醇脱氨酶的基因工程菌或转基因细胞 系，具体制备方法如下：
[0009] 1)采用化学合成或PCR方法克隆编码所述mes〇-2,3-下二醇脱氨酶的基因 B化化；
[0010] 2)将步骤1)获得的B化化基因与质粒祀T28a同时用限制性核酸内切酶BamHI 和EcoRI双酶切，然后使用T4DNA连接酶进行连接，获得重组表达载体祀T28a-B化化；
[0011] 3)将步骤2)获得重组表达载体祀T28a-B化化转化入大肠杆菌化21 0E3)中，获 得重组基因工程菌化21 0E3) /祀T28a-B化化。
[0012] 本发明还进一步设及一种meso-2, 3-下二醇脱氨酶生产制备方法，其包括如下步 骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组还原酶。其中所述的重组表达转化体同前述介 绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。
[0013] 其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可本领域任何可使转化体生长并 产生本发明的脱氨酶的培养基，优选LB培养基：蛋白腺lOg/l，酵母膏5g/l，化C1 10旨/1，抑 7. 0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可W根君宿主细胞的类型和培养方法等因素的 不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生脱氨酶即可。其他 培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。优选下述方法：将表达本发明的脱氨酶 基因的重组大肠杆菌（优选本发明的大肠杆菌化21 0E3))接种至含卡那霉素的LB培养基 中培养，当培养液的光密度0D600达到0. 5-0. 7 (优选0. 6)时，在终浓度为0. 1-1.Ommol/L (优选0. 2mmol/L)的异丙基-P-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)的诱导下，30°C诱导培养化 后，即可高效表达本发明的重组还原酶。离屯、收集菌体并细胞破碎获得粗酶液，再用儀柱进 行纯化，获得重组meso-2, 3-下二醇脱氨酶。
[0014] 所述的meso-2, 3-下二醇脱氨酶是NADH依赖的，分子量大小为120~130kDa，是 同源四聚体。该酶可W催化还原含两个邻位幾基的二酬底物及乙偶姻，且可W氧化2, 3-下 二醇。该酶还原双乙酷的最适反应抑为4. 5~5. 5,对底物乙偶姻有较宽的抑适用范围 巧.0~8. 0)，而氧化2, 3-下二醇最适反应pH为9. 0~11. 0。因此在酸性缓冲液中，该酶 主要发挥还原功能。无论是氧化还是还原，最适反应溫度均为35~40°C。该酶对乙偶姻亲 和力最大，Km为0. 47mmol?L1，且kcat/Km值最大，为432. 41L?mmol1 ?S1，说明乙偶姻是该 酶的最适底物。50°C下，保溫40min酶活下降至50%，说明该酶在50°C下的稳定性并不突 出。该酶不依赖于金属离子发挥催化功能。
[0015] 本发明更进一步设及本发明的重组脱氨酶作为催化剂在不对称还原双乙酷W制 备（2S，3S) -2, 3-下二醇中的应用。
[0016] 较佳的：所述的应用按下述方法进行：双乙酷的浓度为10-500mmol/L;所述的重 组脱氨酶的用量为1-lOkU/L(酶活定义见实施例1);葡萄糖脱氨酶的用量为1-lOkU/L;所 述的葡萄糖的用量为20-1000mmol/L;所述的NAD+的用量为0. 1-1.Ommol/L;所述的憐酸盐 缓冲液的浓度为0.lmol/1，抑6-8 ;所述的不对称还原反应的溫度为25-35°C;所述的不对 称还原反应的时间W反应完全为准，一般为1-12小时。不对称还原反应结束后，可按本领