一种黑曲霉基因敲除方法

文档序号:9447774阅读:827来源:国知局
一种黑曲霉基因敲除方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种黑曲霉基因敲除方法,属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 黑曲霉是一种在自然界广泛存在且表型多样的丝状真菌,在生物技术工业领域中 是最重要的工业生产菌之一,作为生物反应器主要用于生产降解多糖的酶(淀粉酶类、果 胶酶和木聚糖酶)和有机酸(如巧樣酸)。同时,作为基因工程宿主菌生产蛋白和多肤类产 品,黑曲霉和大肠杆菌W及酵母相比,具有糖基化位点更类似于哺乳动物,蛋白分泌系统强 大,培养基更廉价的优势。通过分子改造对黑曲霉的代谢进行调控来实现目的产物的积累 已经有成功的报道。
[0003] 目前,对黑曲霉进行基因敲除时,使用的抗性筛选标记包括两类:营养缺陷型互补 基因(尿喀晚营养缺陷型基因pyrG)和抗性基因,抗性药物包括潮霉素(Hygromycin)和博 来霉素度leomycin)等。其中,对于野生型菌株而言,仅潮霉素对其抑制作用较明显。潮霉 素可W与肤链延长因子EF-2作用,从而抑制肤链的合成。有限的抗性标记限制了对黑曲霉 进行多步遗传操作的可能性。利用营养缺陷型互补基因筛选阳性克隆时,需对营养缺陷型 菌株利用pyrG进行正反双向筛选来进行多轮遗传操作,但对于野生型菌株而言,5-氣乳清 酸的抑菌效果并不明显,而且需要首先敲除pyrG基因才能得到营养缺陷型菌株。目前,利 用潮霉素抗性基因筛选阳性克隆时,是通过瞬时表达CRE蛋白W及转化商品化的CRE酶,W 将loxP位点之间的潮霉素抗性敲除,其缺陷是基因敲除和消除抗性分别需要对黑曲霉进 行转化,每次消除抗性都需要转化黑曲霉,而黑曲霉的转化费时费力。
[0004] 本发明只需要对黑曲霉进行一次转化,将剪切元件和基因敲除表达框同时整合到 黑曲霉基因组中,后续利用诱导型启动子诱导抗性的消除,每次消除抗性都不再设及黑曲 霉的转化,为代谢改造黑曲霉提供了有效的方法和新的思路。

【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供一种黑曲霉基因敲除方法,主要包括剪切元件和基因敲除表 达框的构建,W及抗性消除;所述剪切原件用于诱导表达CRE酶W消除基因敲除表达框中 的抗性基因。
[0006] 所述方法包括W下步骤:
[0007] 1)构建剪切元件和基因敲除表达框,所述剪切元件主要包括W下核屯、元件:来源 于黑曲霉的Xln启动子、CRE重组酶基因和trp终止子;所述基因敲除表达框主要包括W下 核屯、元件:祀基因上游同源臂、loxP位点、甜dA启动子、潮霉素抗性基因hph、t巧终止子、 loxP位点、祀基因下游同源臂;
[000引 2)将剪切元件和基因敲除表达框转化黑曲霉,得到祀基因敲除的阳性克隆;
[0009] 3)将阳性克隆在含有木糖的培养基上继代培养,诱导CRE重组酶基因表达,W消 除潮霉素抗性标记。
[0010] 在本发明的一种实施方式中,所述Xln启动子的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中,所述CRE重组酶基因的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中,所述t巧终止子的序列如SEQIDNO. 1所示。 阳01引在本发明的一种实施方式中,所述loxP位点的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0014] 在本发明的一种实施方式中,所述甜dA启动子的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0015] 在本发明的一种实施方式中,所述潮霉素抗性基因hph的序列如SEQIDNO. 1所 /J、- o
[0016] 本发明的一种实施方式,还包括将消除了潮霉素抗性标记的阳性克隆进行生抱培 养,对抱子进行潮霉素抗性验证。
[0017] 在本发明的一种实施方式中,所述祀基因是0址基因,编码草酷乙酸水解酶基因。
[0018] 在本发明的一种实施方式中,步骤1)中,将CRE重组酶基因和trp终止子通过融 合PCR扩增得到化e-Ttrp片段,将片段反向连接到pMD19上,得到pMD-化e-Ttrp载体,扩 增启动子Xln使启动子两端含有EcoRI和化nI位点,利用EcoRI和化nI双酶切Xln 启动子和pMD-化e-Tt巧,回收片段后连接,得到pXCT载体,再用EcoRI和化ndm双酶切 pXCT得到剪切元件。
[0019] 在本发明的一种实施方式中,步骤2)将剪切元件和基因敲除表达框经PEG介导法 转入黑曲霉原生质体中,在潮霉素抗性的高渗软琼脂me平板上培养得到阳性克隆,再将经 培养4-7天的阳性克隆转移至含200mg/L潮霉素的平板上进一步培养得到阳性克隆。
[0020] 在本发明的一种实施方式中,木糖培养基:1%木糖,0. 5%KC1,0. 5%M拆〇4,1. 5% K&PCVlmg/LFeS〇4,lmg/LZnClz'lmg/LCuS〇4,70mMNaN〇3,pH8. 0。
[0021] 本发明提供了一种对黑曲霉进行基因敲除的方法,将剪切元件和基因敲除表达框 同时整合到黑曲霉基因组中,后续利用诱导型启动子诱导抗性基因的消除,从而只需要对 黑曲霉进行一次转化,就能消除抗性。本发明方法可W用于连续敲除多个基因。应用本发 明方法,我们成功敲除了黑曲霉基因中的0址基因,并实现了潮霉素抗性的消除,抗性消除 后的转化子遗传稳定,形态正常,巧樣酸产量不受影响。
【附图说明】
[0022] 图1所示为剪切元件和基因敲除表达框的结构W及作用方式。 阳02引图2所示为黑曲霉的0址基因敲除的PCR验证。泳道M为分子量标记,ck为野生 型黑曲霉对照,A图为trp和同源臂的扩增,基因敲除菌株可W扩增出2656bp片段,基因未 敲除的菌株扩增不出相应片段。B图为0址基因的扩增,基因敲除菌株扩增不出相应片段, 而基因未敲除的菌株可W扩增出1658bp片段。图中泳道1、2、3、6、7、8、9、11、13、14、15、17 和20为0址基因敲除菌株,而泳道4、5、10、12、16、18和19为0址基因没有敲除的菌株。
[0024] 图3所示为黑曲霉产酸能力的验证。
【具体实施方式】 阳02引实施例1黑曲霉基因组DNA的提取
[0026] 将黑曲霉抱子接种到ME液体培养基(3%麦芽提取物,0.5%膜蛋白腺)中,35°C 25化/min培养48h,用mirocloth收集菌球,用无菌超纯水洗涂3遍,滤干水分,迅速液氮冷 冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎,采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝 状真菌基因组。
[0027] 实施例2剪切元件和基因敲除表达框的构建
[0028] 1)基因敲除表达框的构建: 阳0巧]利用引物 〇址85斗(GAGCTCGTTTAAACTACCAAGGCCAGGCCGCAA)和 〇址85_尺(GCGGCCGC CCGCCAGCAACCAATATTCAT)从黑曲霉基因组中扩增0址基因上游2200bp的片段〇址85,片段 的5'端含有SacI和化eI位点,片段的3'端含有NotI位点;利用引物〇址B3-F(ACTAG 工ACAGAACACCCTGATCGACAGT)和 〇址B3-R(AAGCTTCCTGCTACAAATACATTGACCTC)从黑曲霉基因 组中扩增0址基因下游2200bp的片段〇址83,片段两端含有Spel和化ndm位点。
[0030] 利用引物P甜地-F
[0031] (GCGGCCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTTGTATCTCTACACACAGGCTCA) 和hphB-R(ACTAGTCCGCGGTCGGCATCTACT)从pAN7-l载体上扩增完整的甜dA启动子和hph 半部分片段,命名为h地B,hphB片段两端含有NotI位点和Spel位点,片段内部含有Eco RI位点,在甜dA启动子5'端带有loxP位点,loxP位点通过P甜地-F引物来引入;利用引 物hphB-F(TCGTTGCGTCAGTCCAACATTT)和TtrpB~R(ACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGA AGTTATCTGCAGGTCGAGTGGAGATGTG)从pAN7-l上扩增h地后半部分和t巧终止子
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