一种番茄的高效快速稳定基因转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，特别设及一种番茄的高效快速稳定基因转化方 法。
【背景技术】
[0002] 番茄化ycopersicon esculentum Mill.)是世界上重要的食用作物。它品种多， 产量高，营养丰富，用途广泛。Micro-Tom是一种番茄突变体，它保留了普通番茄作为模式植 物的基本特征，但植株矮小、生命周更短，具有节省研究空间、缩短研究时间的巨大优势。随 着近年来分子生物学和基因工程的飞速发展，研究热点转向番茄种质资源优良基因的深度 挖掘，并进行分子标记和基因表达序列的鉴定和测定。同时在抗逆性、耐胆运、风味品质等 遗传改良等方面的研究结果相继有所报道，番茄育种正朝着分子育种方向发展。而番茄分 子育种的过程中最重要的手段就是番茄转基因。另一方面，对于Micro-Tom来说，从播种开 花到结果，生命周期短，一年中能够多次成花，花序多，可W四季结果。该品种植株矮小，种 植方便。可W作为一种模式植物来研究，尤其是在研究果实的生长发育方面，研究番茄的果 实生长发育机理更容易，具有高效快速的优点。
[0003] 目前常用的番茄基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌 介导的叶盘法是番茄遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟 最常用的一种转基因方法。虽然番茄的遗传转化技术路线成熟，但是传统方法费事费力，耗 时间长，操作繁琐而且效率很低，获得的转基因植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带 来了障碍。传统的农杆菌介导法操作过程比较繁琐，在转基因的过程中容易出现许多问题， 比如合适载体的选择、合适菌株的选择、杂菌的污染、农杆菌无法抑制、菌液浓度过高或者 过低导致转基因不成功、侵染时间长短的控制等等，运些问题都会影响番茄转基因的效率 W及速度，传统方法获得的番茄植株转基因效率不到百分之一。因此如何获得一个高效快 速的番茄稳定转化体系，是番茄转基因中亟待解决的一个问题。本发明就将解决运一问题， 建立了一个高效、快速、稳定的Micro-Tom番茄遗传转化体系，为进一步应用遗传转化方法 改良番茄品种提供实践基础，有利于今后番茄分子育种工作的发展。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种番茄的高效快速稳定基因转 化方法。
[0005] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种番茄的高 效快速稳定基因转化方法，包括W下步骤： 1)菌种活化：将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 °C培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到 50血含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 °C，220巧m在摇床 中振荡培养至0D600值0. 4 ;常溫下，5000rmp离屯、8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣 离屯、管，尽量将上清液去除，用100mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定 0D600值为0. 2~0. 3之间； 2) 植物材料准备：番茄种子种植于S1培养基上，10天W后长出两篇子叶，去子叶将子 叶用剪刀剪成0.4cm2的叶块用于菌液侵染； 3) 侵染：悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染30~40分钟，过程中每隔5 分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸 干表面的菌液； 4) 筛选培养：侵染后的叶片接种在番茄转基因培养基S2上，使伤口与培养基充分接 触，在培养室中25 + 2 °C，光照培养，培养20天左右，番茄叶片边缘会有白色愈伤组织长 出，此时在体式巧光显微镜下进行观察，可W明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，运 部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，运部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，通 过运个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量，保留下的抗性愈伤经过约40d 左右的培养W后，可分化出抗性植株，此时再进行一次巧光检测，在体式巧光显微镜下进行 观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉，抗性植株 生长60天需要再进行一次巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的 可W确定为转基因植株。
[0006] 如果需要获得果实进行果实的试验，可W继续培养，在瓶中番茄就能够开花结果。 开花结果后为了进一步确定转基因的稳定性，可W在巧光显微镜下再次检测花和果实不同 发育阶段的巧光。
[0007] W上步骤完成W后可W获得稳定遗传的转基因植株。此方法操作过程简单，转化 效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。
[0008] 其中，所述S1培养基为MS2. 2g/l，薦糖30g/L，琼脂5. 5g/L，抑5. 8。
[0009]其中，所述S2 培养基为MS2. 2g/L，薦糖 30g/l，琼脂 5. 5g/l，ZTlmg/1，NAA0. 4 mg/L，卡那霉素20mg/l，簇节青霉素400mg/L，抑5. 8。
[0010] 其中，所述番茄为番茄Micro-Tom种子。
[0011]MS:MS是MS培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其 特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数 量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培 养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。具体配方可参照此书：（曹孜义等，实用植物组 织培养教程，1996,甘肃科学技术出版社)。在本转基因实验中我们使用由美国sigma公司 生产MS培养基粉剂（MurashigeandSkoogbasalsaltmix1:ure)，此MS培养基粉剂要求 每配制一升培养基添加4. 4克粉剂，在本培养基的配制中，每配制一升培养基需要加入MS 培养基粉剂2. 2克。
[0012] 所说的继代培养基也就是MS固体培养基，就是在每升液体培养基上加入7克琼脂 粉配成。
[0013]ZT:玉米素（Zeatin)是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧 芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽 部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。
[0014]NAA:糞乙酸（1-Naphthaleneaceticacid)，简称NAA，是一种有机化合物，它是 一种植物激素生长素，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用杆插法繁殖时使用。它 也可用于植物组织培养。
[0015] 卡那霉素：卡那霉素是转基因中的植物筛选标记，通过在培养基中添加卡那霉素， 可W剔除掉一部分非转基因的芽或者植株。转基因植株抗卡那霉素，因此可W在添加卡那 霉素的培养基中成活，而普通植株不抗卡那霉素，会死亡。
[0016] 簇节青霉素：簇节青霉素用于抑制转基因后期农杆菌的生长。
[0017] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点： 1、提高番茄转基因效率，转化率可达到30%W上。
[0018] 2、将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。
[0019] 3、侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂(传统方法中常添加乙酷下香酬 等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力)，减小对番茄叶片的伤害，提高 叶片培养的成活率和再生率。
[0020] 4、使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免 传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干变型和改进，运些也应视为属于 本发明的保护范围。
[0022] 实施例1本发明培养基、菌株和植物表达载体的准备 1、材料 (1)植物材料 番茄Micro-Tom种子和组培苗。
[0023] ( 2 )主要溶液和培养基配制 培养基配制方法如下： 番茄种子培养基：S1 152.2旨/1，薦糖30旨/1，琼脂5.5旨/1，抑5.8，高压灭菌，备用。
[0024] 番茄转基因苗培养基：S2 MS2. 2g/L，薦糖 30g/L，琼脂 5. 5g/L，ZTlmg/L，NAA0.4mg/l，卡那霉素 20mg/L,簇节 青霉素400 111邑/1，抑5.8，高压灭菌，冷却备用。
[0025] ( 3 )菌株和植物表达载体 本发明中使用的菌株是农杆菌菌株EHA105,该菌株是番茄转基因中常用菌株，侵 染能力较强。该菌株购买于美国模式培养物集存库ATCC(Americanty