一种无选择标记的多基因复合性状基因工程猪的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及转基因猪领域，具体而言，设及一种无选择标记的多基因复合性状基 因工程猪的制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪是重要的家畜饲养动物之一，是我国重要的肉食来源，与人们的日常生活密切 相关。随着转基因技术的迅猛发展，猪已经被推上育种改良、医学应用、商业运作的舞台，身 处前所未有的机遇之中。
[0003] 虽然转基因动物是最有发展前景的课题之一，但是制作转基因动物的低效率和W 抗生素抗性基因作为选择标记所带来的动物福利、食品安全的潜在风险等是目前普遍存在 的问题也是主要的制约因素。目前动物基因工程方法每次转基因只整合一个目的基因，进 而制备表达单基因的基因工程动物，而实际情况是动物的特性往往不是由一个基因决定 的，即动物的一种特性与多个基因相关，或者，现实当中需要基因工程动物具有两种W上的 基因特性，我们称之谓复合性状。生产实际中多基因复合性状基因工程动物更有实用价值。 如果设及制备多基因复合性状的基因工程动物，则需单独制备相应的单基因基因工程动 物，然后通过基因工程动物间的交配等方法制备转多基因动物的后代，运种制备多基因动 物的方法费时费力而且耗费高。选择标记基因伴随着目的基因，通过选择标记基因的表达 而确定目的基因是否成功转入。然而，在细胞转入介质或受体后，选择标记基因不再起任何 作用。近年来，研究者们提出选择标记基因的存在对人类健康和环境有着无法预测的危害， 可能破坏种群生态平衡性和影响遗传多样性。对于转基因动物，选择标记基因主要包含抗 生素抗性基因，例如对氨基糖巧类抗生素产生抗性的卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因 和链霉素抗性基因。来源于转基因动物的动物食品通过食物链可能使抗生素抗性基因产物 进入人体，在生态环境中灭活普通剂量的抗生素药物，对人类公共健康乃至整个生态环境 构成威胁。
[0004] 考虑到选择标记基因的弊端，克服运一问题最好的办法就是移除选择标记基因。 目前在植物上研究较多，例如，农杆菌介导的共转化方法，将目的基因和选择标记基因分别 插入不同T-DNA上，共同转入并筛选出转基因植物，通过自交分离筛选出不带有选择标记 基因的植物。
[0005] 在诱导性启动子下利用位点特异性重组去剔除选择标记基因，目前应用最为广泛 的是化e/loxP系统。大肠杆菌P1隧菌体ere基因产物能识别loxP位点并催化两者的重 组，当两者被特异性识别并结合后，可W启动目的基因的表达。筛选出转基因作物或动物 后，需要通过杂交剔除带有选择标记基因的后代；也可W在细胞水平通过识别loxP位点将 抗生素抗性基因剔除。
[0006] 安全选择标记基因，是指使用非抗生素抗性基因W外的选择标记基因。运一标记 基因的选择基于其编码的蛋白不被受体代谢，并且使转化细胞具有代谢和发育的有利条 件。例如，植物将己糖甘露糖被转化为甘露糖-6-憐酸，因缺少代谢甘露糖-6-憐酸的相关 酶类，甘露糖-6-憐酸不能被进一步利用，而PMI催化甘露糖-6-憐酸转化为果糖，果糖是 糖酵解途径的前体。Weisser等（1996)通过甘露糖憐酸异构酶PMI作为选择标记基因，使 转化的细胞获得代谢优势，而非转基因细胞仍无法代谢甘露糖-6-憐酸。与此相似的安全 选择标记基因还有木糖异构酶xylA和核糖醇操纵子dl，除糖类代谢基因之外，还有激素 合成相关基因和基于可视化选择的GFP基因。此类标记基因大多来源于动植物本身，作用 机理类似于传统标记基因，但不会对生物体和环境造成潜在危害，其使用方法也较为成熟， 有的标记基因也可作为目的基因进行表达。
[0007] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种制备无选择标记的多基因复合性状基因工程猪的 方法，创制无选择标记的多基因复合性状基因编辑动物猪，实现了对A12脂肪酸去饱和 酶（Fad-2)和线虫（C.b;riggsae)〇-3脂肪酸去饱和酶基因（S化t-1)同时转入。在获 得无选择标记的转sFatl-2A-Fad2的阳性细胞的基础上，采取体细胞核移植的方法制备 sFatl-2A-Fad2转基因猪，获得富含n-3不饱和脂肪的转基因猪，从而加快猪的肉质改良速 度，为人类提供营养更加丰富的猪肉，具有重要的实际意义。
[0009] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[0010] 一种无选择标记的多基因复合性状基因工程猪的制备方法，包括W下步骤：
[0011] W携带有无选择标记的sFat-l-2A-Fad-2基因片段的成纤维细胞作为供体，去核 的成熟的猪卵母细胞作为受体，采用体细胞核移植的方法获得含有无选择标记的多基因复 合性状基因的重构胚胎；
[0012] 将所述重构胚胎进行体外培养后，移植到代孕的猪体内，猪分娩后，即得到无选择 标记的多基因复合性状基因工程猪。
[0013] 本发明提供的一种无选择标记的多基因复合性状基因工程猪的制备方法，是将无 选择标记的sFat-l-2A-Fad-2基因义取体细胞核移植的方法制备sFatl-2A-Fad2转基因 猪，获得富含n-3不饱和脂肪的转基因猪，从而加快猪的肉质改良速度，为人类提供营养更 加丰富的猪肉；并且转入的基因不带有选择标记基因，避免了选择标记基因带来的潜在危 害。
[0014] 优选地，挑选直径为5-8mm的卵泡抽取卵母细胞，将所述卵母细胞进行体外成熟 培养得到成熟的猪卵母细胞。猪卵母细胞体外成熟率、成熟质量与卵泡大小密切相关，当卵 母细胞直径小于3mm时，自身不具备体外成熟能力；而当卵母细胞直径大于6mm时，经后期 培养可能出现老化现象，特定选用直径为5-8mm的卵泡抽取卵母细胞，培养得到的卵母细 胞成熟率高，且质量好。
[0015] 优选地，所述卵母细胞进行体外成熟培养得到成熟的猪卵母细胞具体为：
[0016] 将所述卵母细胞在38. 5 + 0. 5°C、5% ±1% 0)2、饱和湿度条件下培养39-4比。
[0017] 经过该步骤培养得到的成熟的卵母细胞活力好，利于后续操作。
[0018] 优选地，所述的去核的成熟的猪卵母细胞采用的卵母细胞为生长状态良好并排出 第一极体的卵母细胞；且所述卵母细胞在去核操作前先用透明质酸酶溶液进行反复吹打， W脱去卵丘细胞。
[0019] 优选地，冻存的供体细胞复苏时间在卵巢采集当天进行；
[0020] 对冻存的供体细胞复苏时，从液氮中快速取出细胞迅速置于38 +rC的水浴中不 停晃动，细胞在Imin之内融化；
[0021] 融化后的细胞转移到离屯、管并加入37 +rc预热的完全培养基，吹打混匀后离心 得到的细胞进行重悬，接种到37 +rC预热的完全培养基进行培养，培养24+1小时后，用 DPBS洗1-2次，然后换液一次；
[0022] 培养至细胞密度在78% -82%时消化细胞，即可进行细胞核移植操作。
[0023] 优选地，所述体细胞核移植的方法具体为：
[0024] 成熟的卵母细胞经去核操作去除第一极体，然后移入操作滴条中；
[0025] 选取中等大小、折光性强，形态圆润，胞质致密，活力较好的受体细胞，吸入注射针 中，注射针置于细胞操作滴中；
[0026] 持定针置于去核的卵母细胞下方，给予吸紧细胞的力，吸紧细胞后，调节焦距，使 去核的卵母细胞与注射针在同一平面，稍微给注射针一点向外打受体细胞的力，待受体细 胞移动至注射针口的瞬间快速刺入卵母细胞的卵周隙，待受体细胞进入卵母细胞后迅速移 出注射针，得到重构卵细胞；
[0027] 所述重构卵细胞经激活和融合，经培养得到重构胚胎。
[002引优选地，所述重构卵细胞的激活具体为：所述重构卵细胞放入H199操作液中洗 1-2遍，放入激活液中平衡l-3min，放入后重构卵细胞下沉时及迅速取出；
[0029] 融合槽内放入激活液，空激两下预热后，将重构卵细胞放入激活槽内；
[0030] 所述化99操作液和所述激活液在使用前预热。
[0031] 优选地，所述融合采用电击的方式进行；
[0032] 所述电击采用融合仪进行，所述融合仪参数为：2. 0kv/cm，50us。
[0033] 优选地，所述融合具体为：调整重构卵细胞方向使其中的供体细胞与卵母细胞接 触面垂直于电流方向，电击一次；
[0034] 电击后移出，放置于化99中，清洗=次，移至胚胎培养液中漂洗3-4遍，放至 38±0.5°C，5%±1%C〇2 培养箱培养。
[0035] 优选地，所述代孕的猪体为：连续2-3次发情周期正常的健康长白母猪，且发情时 间控制在4化之内。
【附图说明】
[0036]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，W下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0037] 图1为本发明实施例1中MLC载体的示意图；
[003引图2为本发明实施例2中外围有3层W上卵丘细胞紧密包围的卵母细胞显微镜 40X观察图；
[0039] 图3本发明实施例2中成熟的卵母细胞显微镜40X观察图；
[0040] 图4本发明实施例2中成熟卵母细胞移核过程图；
[0041] 图5为本发明实施例2中细胞分裂24h形态显微镜40X观察图；
[0042] 图6为本发明实施例2中细胞分裂4化形态显微镜40X观察图；
[0043] 图7为本发明实施例2中6d囊胚的形态显微镜40X观察图；
[0044] 图8为本发明实施例4中阳性质粒DNA电泳图；
[004引图9为本发明实施例4中猪耳组织DNA电泳图；
[0046] 图10为本发明实施例4中不同基因进行PCR产物电泳图，A为sFatl;B为化d2; C为2A序列；
[0047] 图11为本发明实施例4中转基因猪不同组织提取RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[004引图12为本发明实施例3中sFatl基因和化d2基因在转基因猪不同组织中RNA表 达水平的QPCR检测结果柱形图。
【具体实施方式】
[0049] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议