-噻唑啉-4-羧酸合成l-半胱氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶法转化化-2-氨基-A2-喔哇 晰-4-駿酸值kATC)合成k半脫氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] k半脫氨酸是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团琉基（-SH)的 氨基酸，具有重要的生理功能。目前已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。我国是 k半脫氨酸生产大国，占全球总产量的80%，产品不仅占领了国内市场，而且大量出口到 世界各地。目前，国内生产心半脫氨酸主要是依靠人或动物的毛发中的角蛋白经酸水解 提取k脫氨酸后，再经过电解还原制得k半脫氨酸。该方法收率低，能耗高，水解过程产 生大量刺激性气体，废液处理困难，对环境污染严重。近年来，随着k半脫氨酸生产技术 的发展，国际上逐步W微生物转化法取代了毛发水解制备心半脫氨酸。微生物转化法中W 化-ATC酶法转化最具优势。化-ATC酶法转化是利用微生物细胞内所含有的转化酶系（包 括化-ATC消旋酶a-ATC水解酶、硫-氨甲醜半脫氨酸水解酶、氮一氨甲醜半脫氨 酸水解酶）将化-ATC生物转化为k半脫氨酸。送个方法是1977年日本Sano等人提出的， 他们从±壤中筛选到的假单胞菌（Pseudomonassp.)可将化-2-氨基-A2-喔哇晰-4-駿 酸值kATC)生物转化为心半脫氨酸。此法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物 少、产物均一、易提取等优点，很适宜合成用发酵法生产比较困难的氨基酸。
[0003] 虽然国际上微生物酶法转化化-ATC合成k半脫氨酸送一技术已有较为成熟的应 用，但由于存在菌体使用寿命不长（由于L-ATC水解酶在生理温度的热稳定性不高，易变 性，其半衰期很短），酶促反应途径中的酶均为诱导酶，对底物响应时间长，野生菌株中酶量 不足、活力相对较低等使得整套工艺的连续生产能力被大大限制，生产成本居高不下，一般 该法只用于医用级高纯度k半脫氨酸的产生。特别是野生菌中存在半脫氨酸的分解代谢 途径，转化过程中积累的心半脫氨酸被分解，释放出大量的的&S气体，严重影响了产率。 而目前由于对菌株基因组信息的缺乏W及一些未知的原因，对野生假单胞菌的基因工程改 造工作难度很大，一直进展不前。
[0004] 由此可见，创立一套高效、高产率的微生物酶法转化化-ATC合成k半脫氨酸的新 方法就显得十分重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于解决现有技术存在的利用野生型假单胞菌法转化化-2-氨 基-A2-喔哇晰-4-駿酸值L-ATC)合成k半脫氨酸工艺中遇到的技术问题，提供一种更 为高效的酶法转化化-ATC合成k半脫氨酸的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种酶法转化化-ATC合成k半脫氨酸的方法，包括如下步骤：
[000引 （1)基因工程菌细胞膜的透膜处理
[0009] 将经诱导表达后的用于转化化-ATC合成心半脫氨酸的基因工程菌先后用正己焼 和二甲苯进行透膜处理，离必收集透膜处理的菌体，用磯酸盐缓冲液洗涂后备用。其中，用 于转化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程菌为敲除半脫氨酸脱琉基酶基因且能异源共 表达由化-ATC消旋酶、刚性连接肤和kATC水解酶所组成的融合蛋白AtcAB和氮一氨甲 醜-k半脫氨酸水解酶AtcC的大肠杆菌；
[0010] 所述的融合蛋白AtcAB的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示；所述的氮一氨甲 醜-k半脫氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0011] 似固定化细胞的制备
[0012] 通过海藻酸巧包埋法将步骤（1)所获得的经透膜处理的基因工程菌固定得到固 定化细胞。
[001引 （3)固定化细胞转化化-ATC生成心半脫氨酸
[0014] 将步骤似得到的固定化细胞加入到含有反应物化-atc、kh2P〇4、山梨醇的体系中 进行反应得到k半脫氨酸。
[0015] 步骤（1)中所述的大肠杆菌为染色体上整合有受A瞻菌体DE3区的lacUV5启动 子控制的T7瞻菌体RNA聚合酶基因的大肠杆菌，如化21 0E3)、JM109 〇)E3)等中的任意一 株，送些菌株可从NovageruPromega等生物技术公司购买。该类菌株有利于在T7启动子控 制下的外源基因的表达。
[0016] 步骤（1)中所述的半脫氨酸脱琉基酶基因为tnaA和malY基因，其优选通过Red重 组系统进行敲除。根据Genbank公布的大肠杆菌基因组序列，设计引物对tnaA及malY基 因进行敲除。WpKD4质粒为模板，用所设计的引物通过PCR(聚合酶链式反应）扩增带有 卡郝霉素抗性基因的同源重组片段。将地D46质粒导入大肠杆菌中，诱导产生同源重组所 需的酶后，收获菌体并制备电转化感受态细胞；将50-200yL的感受态细胞与10-20ng的同 源重组片段混合后加入电击杯中（于Bio-Rad公司购买），通过电穿孔仪（于Bio-Rad公司 购买）电击，电压设置1700-2500V。将电击液用800yLS0C培养基稀释，然后通过卡郝霉 素抗性平板筛选重组子，然后设计引物，PCR验证敲除的正确性。然后培养重组大肠杆菌 并制备感受态细胞，转化PCP20质粒，通过温度诱导表达FLP内切酶将抗性基因从基因组上 切除掉。
[0017] 敲除基因tnaA及malY所用的引物分别为：
[0018]tnaAup：
[0019] 5^-ATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGCATTCGTGTTATTGAGCAAGTGTAGGCTGGA GCTGCTTC-3'，
[0020] tnaAdown：
[0021] 5^-TTAAACTTCTTTAAGTTTTGCGGTGAAGTGACGCAATACTTTCGGTTCGTACATGGGAATTAGCCA TGGTCC-3';
[0022] mal化p:
[0023] 5，-ATGTTCGATTTTTCAAAGGTCGTGGATCGTCATGGCACATGGTGTACACAGTGGGAAAGTGTAGGC TGGAGCTGCTTC-3>，
[0024]malYdown：
[00巧]5，-TCCAGCCACACCTTTTTCCAGTTTCGAACGTGGGCAGCCGGCATTGAGACGGATGGGAATTAGCCA TGGTCC-3'。
[0026] 验证上述tnaA及malY基因敲除所用的引物分别为：
[0027]tnaAtestup;5, -TTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3，，
[0028]tnaAtestdown;5' -AGGATGTAGGGTAAGAGAGTGG-3'；
[0029]malYtestup;5, -TCGGGCAATTGGCGTAGTAC-3，，
[0030]malYtestdown;5' -GCAATTGGGTTAACGAACAG-3'。
[0031] 上述质粒地D4含有两边为FRT位点的卡郝霉素抗性基因，是Red重组系统中的常 规质粒，其可在市场上随意购买得到。质粒地046(〇1'11?10山日9410118?日拘8-旨日111-6日1：-6又〇 Amp)是温度敏感型质粒，能在阿拉伯糖的诱导下表达同源重组需要的H个A瞻菌体重 组酶Gam、Bet和Exo,其是Red重组系统中提供重组酶的质粒，可在市场上随意购买得 至IJ。质粒PCP20为温度敏感型质粒，热诱导后表达FLP重组酶，能识别FRT位点并促进 重组的发生，其亦可在市场上随意购买得到。所述质粒地D46、P邸4及PCP20的构建及 应用见下述文献：1.D曰tsenkoKA,W曰nnerBL.One-stepin曰ctiv曰tionofchromosom曰 1 genesinEscherichiacoliK-12usingPC民products.ProNatlAcadSciUSA 2000,97:6640-6645 ;2.Red重组技术研究进展，中国生物工程杂志，2006, 26(1) ;81-86; 3.Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用，遗传，2003, 25巧）=628-632。
[0032] 步骤（1)中的化-ATC消旋酶a-ATC水解酶和氮一氨甲醜半脫氨酸水解酶的 编码基因均来源于假单胞菌PseudomonasSP.BS株，送些编码基因的序列均经过密码子优 化。编码由化-ATC消旋酶、刚性连接肤和心41'(：水解酶所组成的融合蛋白的核巧酸序列如 SEQIDNO. 2所示，编码氮一氨甲醜-k半脫氨酸水解酶的核巧酸序列如SEQIDNO. 5所 /J、- 〇
[0033] 优选的，步骤（1)中所述的用于转化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程菌通过 包括如下步骤的方法构建得到：
[0034]a.将序列如SEQIDNO. 3所示的DNA片段通过NdeI、EcoRI酶切位点连接到复制 子为n的祀T-28a(+)载体上构建得到表达由化-ATC消旋酶、刚性连接肤和kATC水解酶 所组成的融合蛋白的表达载体（pET-atcAB)。所述表达载体祀T-28a(+)为Novagen公司产 品，可随意从市场购买。
[0035]b.将序列如SEQIDNO. 6所示的DNA片段通过EcoRI、化01酶切位点连接到 复制子为P15A的PACYC184载体上构建得到氮一氨甲醜半脫氨酸水解酶表达载体 (pAC-atcC)。所述载体pACYC184为化W化glandBiol油S公司产品，亦可随意从市场购买。
[0036]C.将上述两种因具有不同的复制子从而具备相容性的表达载体共同转入敲除半 脫氨酸脱琉基酶基因的大肠杆菌中，即得到用于转化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程 菌。
[0037] 步骤（1)中所述的基因工程菌的干重与正己焼的体积比优选为lmg:5-40uL，基 因工程菌的