干重与二甲苯的体积比优选为Img: 10-50yL。
[0038] 步骤（1)中所述的透膜处理的条件优选为3(TC透膜处理5-40min。
[0039] 优选的，步骤（2)为：将所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到15g/L的海藻 酸钢溶液中混合均匀，使得菌体（细胞干重）浓度为5-20mg/mU将混合液逐滴滴入到20g/ L的氯化巧溶液中得到固定化细胞。再将固定化细胞放置在20g/L的氯化巧溶液中，4°C过 夜。固定化细胞再用无菌水洗涂后，置于4°C备用。
[0040] 步骤（3)中的反应体系优选为：固定化细胞浓度为50-300g/l，反应物化-ATC浓 度为5-20g/L，KH2PO4浓度为0. 5-2g/l，山梨醇浓度为10-200g/L，抑为6-8。
[0041] 步骤（3)中所述的反应的条件优选为：反应温度为28-37C，揽拌转速为100-200 转/分钟，反应时间为2-化。
[0042] 转化反应完成后，通过过滤即可把固定化细胞回收，回收的固定化细胞用KH2PO4 浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、抑为7. 5的洗涂缓冲液洗涂后，可再次用其建立上述 反应体系转化化-ATC生成k半脫氨酸。
[0043] -种用于转化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程菌，为上述敲除半脫氨酸脱琉 基酶基因且能异源共表达由化-ATC消旋酶、刚性连接肤和kATC水解酶所组成的融合蛋 白和氮一氨甲醜-k半脫氨酸水解酶的大肠杆菌。
[0044] -种用于转化化-ATC合成k半脫氨酸的固定化细胞，通过海藻酸巧包埋法将用 于转化化-ATC合成k半脫氨酸的基因工程菌固定得到。
[0045] 心半脫氨酸是大肠杆菌中的重要氨基酸，其分解代谢主要由半脫氨酸脱琉基酶完 成，其催化的反应为服邸2邸(畑2)COOH+HzO-CH3COCOOH+H2S+NH3。野生型大肠杆菌细胞内有 多种半脫氨酸脱琉基酶基因，本发明通过敲除其起主要降解作用的脱琉基酶基因tnaA及 malY，使得k半脫氨酸不被其分解利用，从而在大肠杆菌细胞内积累下来。
[0046] 酶转化化-ATC合成k半脫氨酸的代谢途径中有H个关键性的酶；催化化-ATC形 成kATC的化-ATC消旋酶；催化kATC水解形成氮一氨甲醜半脫氨酸的kATC水解 酶；催化形成k半脫氨酸的氮一氨甲醜半脫氨酸水解酶；送H个酶仅存在于某些假单 胞菌体内；本发明将编码送H个关键性的酶的基因同时克隆到已敲除半脫氨酸脱琉基酶基 因的大肠杆菌中进行过量表达，即在大肠杆菌中实现W化-ATC为底物，转化合成k半脫氨 酸。
[0047] 由于大肠杆菌细胞膜对底物化-ATC存在通透性障碍，使得化-ATC较难进入细胞 与上述H个关键酶发生酶促反应，导致化-ATC的转化率受限。本发明采用多种有机溶剂 对大肠杆菌基因工程菌细胞进行复合透膜处理，提高了基因工程菌对底物化-ATC及产物 k半脫氨酸的通透性，从而有效提高了基因工程菌的转化效率。
[0048] 本发明通过对大肠杆菌染色体DNA进行定点基因敲除，有效抑制了菌体内k半脫 氨酸脱琉基酶的活性，同时巧妙地将来自于假单胞菌的生物转化基因经密码子优化后通过 融合基因等形式导入经基因定点敲除的大肠杆菌中，成功获得了能转化化-ATC合成k半 脫氨酸的基因工程菌。同时进一步通过对基因工程菌进行复合透膜处理及细胞固定化，在 强化工程菌吸收底物及外排产物k半脫氨酸的能力的同时亦提高了其操作稳定性。转化 实验结果表明，固定化的基因工程菌可高效的转化化-ATC合成k半脫氨酸，其转化率达到 93%W上；转化稳定性实验表明，固定化的菌体能较好的保持催化活力，间歇操作第10批 次转化反应的转化率仍达到了第一批次转化率的80%左右。本发明为实现k半脫氨酸的 工业化生产奠定了基础。
[0049] 和现有的利用假单胞菌转化化-ATC制备k半脫氨酸的传统方法相比，本发明具 有如下优点和效果：
[0050] (1)利用大肠杆菌基因组背景清晰的优势，敲除了其起主导作用的k半脫氨酸水 解酶基因，使得转化产物可W在细胞中积累；而目前假单胞菌遗传背景不清，敲除相关基因 的工作至今未有任何进展。
[0051] (2)将转化途径中的关键酶基因atcA与atcB基因进行密码子优化后，利用刚性连 接肤将此二基因进行首尾相连而构建融合表达载体，进行融合蛋白的表达，融合蛋白具有 两种酶活力，且稳定性高。
[0052] (2)利用密码子优化的技术，通过两种复制相容性质粒载体，利用两种不同的启动 子灯7启动子及Tac启动子）对化-ATC消旋酶a-ATC水解酶融合蛋白及氮一氨甲醜-心半 脫氨酸水解酶基因进行共表达，消除了启动子的竞争因素造成的基因表达不均衡，实现了 二基因的高效共表达（表达量分别为细胞总蛋白的10%及15% )，从而实现了高效转化； 而野生假单胞菌中相关酶均为诱导酶，需要DL-ATC的诱导，其响应速度慢，转化率低。
[0053] (3)用两种有机溶剂对基因工程菌进行了有效的透膜处理，提高了化-ATC的渗透 能力与产物的外排能力，进一步提高了转化率。
[0054] (4)利用细胞固定化技术，提高了基因工程菌的操作稳定性。
[00巧]将本发明应用到心半脫氨酸的工业化生产中，可极大的提高生产效率与降低生 产成本，其具有重要的工业应用价值。
【具体实施方式】
[0056] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0057] 实施例1大肠杆菌JM109 〇)E3)k半脫氨酸脱琉基酶基因tnaA的敲除
[0058] 1、材料
[0059]菌种；大肠杆菌JM109 〇)E3)，购自Promega公司。
[0060] 质粒；质粒地D4、P邸46、PCP20均购自武汉竊灵生物科技有限公司。
[0061]LB培养基；蛋白腺lOg/l，酵母粉5g/l，化C1lOg/L。
[0062] 卡郝霉素抗性平板；含有20mg/L卡郝霉素、1. 5 %琼脂粉的LB固体培养基。
[0063]S0C培养基；蛋白腺 2g/l，酵母粉 0. 5g/l，化C1 0. 0585g/L，KCl0. 0186g/L，MgCl2 0. 203g，M拆〇40. 246g/l，葡萄糖 20mmol/L。
[0064] 2、方法
[0065] (l)tnaA基因同源重组片段的克隆
[0066] 利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的大肠杆菌tnaA基 因（Genebank登录号为；K00032. 1)的序列设计引物：
[0067]tnaAup：
[0068] 5^-ATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGCATTCGTGTTATTGAGCAAGTGTAGGCTGGA GCTGCTTC-3'，
[0069]tnaAdown：
[0070] 5^-TTAAACTTCTTTAAGTTTTGCGGTGAAGTGACGCAATACTTTCGGTTCGTACATGGGAATTAGCCA TGGTCC-3'。
[0071]WP邸4质粒为模板，用引物tnaAup、tnaAdown通过PCR(聚合酶链式反应）体外 扩增获得带有卡郝霉素抗性基因的tnaA基因同源重组片段。
[0072]PCR反应体系为；10X缓冲液 5yL，25mmol/LMgClz4yL，lOmmol/L四种dNTP混 合液1yL，上下游引物（引物浓度为20ymol/L)各2yL，化qDNA聚合酶1yL;模板DM 1y以加水补至50yL。
[0073]PCR反应条件为；97°C预变性 5min;94°C变性 45s，58°C退火 45s，72°C延伸 120s, 30个循环后72°C延伸10min，4°C保存。
[0074] 回收纯化浓缩PCR产物即得到tnaA基因同源重组片段。
[0075] 似电转化感受态细胞的制备
[0076] 1)通过化C12法将地D46质粒转化入大肠杆菌JM109 〇)E3)菌株中，获得阳性转化 子。
[0077] 2)挑取带有地D46质粒的大肠杆菌JM109〇)E3)，转入LB培养基中，同时加入 0. 2%的阿拉伯糖，培养ODe。。至0. 5。
[0078] 3)冰浴15min，离必收集菌体，然后用10%的甘油洗涂H次。
[007引 4)加入10%的甘油，分装感受态细胞。
[0080] (3)电转化，筛选重组子
[0081] 1)往lOOuL带有地D46质粒的JM109〇)E3)感受态细胞中加入lOngtnaA基因 同源重组片段，混匀后转到电击杯中（于Bio-Rad公司购买）。通过电穿孔仪（于Bio-Rad 公司购买）电击，电压2. 5Kv。
[008引 2)往电击液中加入900yLS0C培养基，37°C、150转/min培养比。
[0083] 3)涂布卡郝霉素抗性平板，挑取重组子。进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步 证实tnaA基因已被卡郝霉素抗性基因替换。所用PCR引物如下：
[0084]tnaAtestup;5> -TTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3>,
[0085]tnaAtestdown;5' -AGGATGTAGGGTAAGAGAGTGG-3'。
[0086] 4)PLP位点专一重组
[0087] 将PCP20转入tnaA基因被卡郝霉素抗性基因替换的克隆中，30°C培养化，后提高 至42C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环廳取菌液在无抗性培养 基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡郝霉素抗性平板上培养，在无抗性平 板上生长而在卡郝霉素抗性平板上不生长的单克隆即为卡郝霉素抗性基因已被FLP重组 酶删除的目的菌株。利用检测引物tnaAtestup和tnaAte