例 4 基因工程菌JM109〇)E3)AtnaAAmalY+atcAB+atcC的表达
[0139] 1、材料
[0140] 菌种；工程菌株JM109〇)E3)AtnaAAmalY+atcAB+atcC，其详细特性见实施例3。 [01川LB培养基運白腺lOg/L，酵母粉5g/L，化C1lOg/L。
[0142] 卡郝霉素+四环素双抗培养基；含有20mg/L卡郝霉素、lOmg/L四环素的LB培养 基。
[0143] 2、方法
[0144] 用接种环挑取平板上的工程菌株JM109 〇)E3)AtnaAAmalY+atcAB+atcC接入装 有50血卡郝霉素+四环素双抗培养基的300血H角瓶中，于37°C、220转/min培养12hW 获得种子液。将种子液按照1%的接种量接入到装有50mL卡郝霉素+四环素双抗培养基的 300血H角瓶中，于37°C、220转/min培养。培养至12h，加入IPTG(异丙基-目-D-硫代半 乳糖巧）至终浓度为ImM。发酵地后离必收集菌体，超声破碎后分别收集超声上清及沉淀， 进行SDS-PAGE鉴定。结果发现，AtcAB、AtcC两种目标蛋白均在细胞内得到了可溶性共表 达，激光薄层扫描显示其表达量分别为细胞总蛋白的10%及15%。鉴定成功表达后，计算 菌体的干重。菌体干重的测量原理如下：测定菌体样品在600nm处的吸光度，然后根据菌体 吸光度与细胞干重的标准曲线将样品吸光度转换为相应的干重质量。
[0145] 实施例5基因工程菌JM109〇)E3)AtnaAAmalY+atcAB+atcC细胞膜的透膜处理 [014引取lOOmg(干重）实施例4所获得的经表达后的菌体，加入lOOOyL正己焼，3(TC 处理20min，8000rpm离必收集菌体，用磯酸盐缓冲液化9g/L磯酸氨二钢，0. 295g/L磯酸二 氨钢，2g/L氯化钢，pH7.3)洗涂一次后，800化pm离必收集菌体，再加入2500UL二甲苯， 30°C透膜处理20min，SOOOrpm离必收集菌体，用上述磯酸盐缓冲液洗涂后，收集备用。
[0147]实施例6基因工程菌JM109〇)E3)AtnaAAmalY+atcAB+atcC的固定化
[0148] 将实施例5所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到10血浓度为15g/L的海藻 酸钢溶液中混合均匀，使得菌体浓度为lOmg/mL。将混合液用6号针头注射器逐滴滴入到 20g/L的氯化巧溶液中得到固定化细胞。将固定化细胞放置在20g/L的氯化巧溶液中，4°C 过夜。用无菌水洗涂3次，置于4°C备用。
[0149]实施例7固定化细胞的催化转化反应
[0150] 建立体积为IL的转化反应体系，转化反应体系及反应条件如下；体系中含有实施 例6中得到的固定化细胞150g，反应物DkATC15g，KH2PO4I. 5g，山梨醇lOOg，转化反应体 系抑为7. 5 ;反应温度为30°C，揽拌转速为150转/分钟，反应时间为化。
[0151] 反应完成后，取反应液检测k半脫氨酸的含量，具体的检测方法见参考文献： Gaitonde,M.K.，Aspectrophotometricmethodforthedirectdeterminationof cysteineinthepresenceofothernaturallyoccurringaminoacids.Biochemistry Journal, 1967, 104,627-633.根据产物心半脫氨酸与底物化-ATC的分子摩尔比，计算转化 率。在此反应条件下，DL-ATC转化为k半脫氨酸的转化率达93%W上。
[0152] 转化反应完成后，通过过滤即可把固定化细胞回收，回收的固定化细胞用KH2PO4 浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、抑为7. 5的洗涂缓冲液洗涂3次后，再次用其建立上 述转化反应体系，进行转化反应。如此反复循环，实现海藻酸钢固定化基因工程大肠杆菌细 胞多次转化化-ATC合成k半脫氨酸。在此条件下，固定化细胞使用十个周期时，反应体系 的转化率仍在80%W上。各个周期的转化率如下表：
[0153]
[0154]
[0155] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 基因工程菌细胞膜的透膜处理 将经诱导表达后的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌先后用正己烷和二 甲苯进行透化处理，离心收集透膜处理的菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤后备用；其中，用于转 化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由 DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸 水解酶的大肠杆菌； 所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示；所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸 水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示； (2) 固定化细胞的制备 通过海藻酸钙包埋法将步骤（1)所获得的经透膜处理的基因工程菌固定得到固定化细 胞； (3) 固定化细胞转化DL-ATC生成L-半胱氨酸 将步骤（2)得到的固定化细胞加入到含有DL_ATC、KH2P04、山梨醇的体系中进行反应得 到L-半胱氨酸。2. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的大肠杆菌为染色体上整合有受A噬菌体DE3区的lacUV5启动子控 制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的大肠杆菌；所述的半胱氨酸脱巯基酶基因为和? 基因。3. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：编 码步骤（1)中所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，编码步骤（1)中所述的氮 一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。4. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步 骤（1)中所述的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌通过包括如下步骤的方法 构建得到： a. 将序列如SEQIDNO. 3所示的DNA片段通过AWeI、及连接到pET-28a(+)载体 上构建得到ATC消旋酶表达载体； b. 将序列如SEQIDNO. 6所示的DNA片段通过及、AfcoI连接到pACYC184载体上 构建得到L-ATC水解酶和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶表达载体； c. 将上述两种表达载体共同转入敲除半胱氨酸脱巯基酶基因的大肠杆菌中，即得到用 于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌。5. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步 骤（1)中所述的基因工程菌的干重与正己烷的体积比为lmg:5-40ML，基因工程菌的干重与 二甲苯的体积比为lmg:l〇-5〇ML;所述的透膜处理的条件为30°C透化透膜5_40min。6. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步骤 (2)为：将所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到15g/L的海藻酸钠溶液中混合均匀，使 得菌体浓度为5-20mg/mL，将混合液滴入到20g/L的氯化钙溶液中得到固定化细胞凝胶珠； 再将固定化细胞凝胶珠放置在20g/L的氯化钙溶液中，4°C过夜；固定化细胞再用无菌水洗 涤后，置于4°C备用。7. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（3)中的反应体系为：固定化细胞浓度为50-300g/L，DL-ATC浓度为5-20g/L， KH2PO4浓度为0. 5-2g/L，山梨醇浓度为10-200g/L，pH为6-8 ;步骤（3)中所述的反应的条 件为：反应温度为28-37°C，搅拌转速为100-200转/分钟，反应时间为2-6h。8. 根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步 骤（3)反应完成后通过过滤回收固定化细胞，再用KH2PO4浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/ L、pH为7. 5的洗涤缓冲液洗涤固定化细胞后重复用于步骤（3)。9. 一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于：为敲除半胱氨 酸脱巯基酶基因且能异源共表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融 合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌。10. -种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的固定化细胞，其特征在于：通过海藻酸钙 包埋法将权利要求9所述的基因工程菌固定得到。
【专利摘要】本发明公开了一种酶法转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸合成L-半胱氨酸的方法。本发明通过海藻酸钙包埋法将经过透膜处理的基因工程菌固定得到固定化细胞，其能够转化DL-ATC生成L-半胱氨酸。所述基因工程菌为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达DL-ATC消旋酶/L-ATC水解酶融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌；通过将SEQ？ID？NO.2和5所示序列分别构建到表达载体上，再转化到敲除<i>tnaA</i>及<i>malY</i>基因的大肠杆菌中得到该工程菌。本发明的固定化细胞转化DL-ATC为L-半胱氨酸的效率高达93%，具有转化率高、生产成本低等优点，在L-半胱氨酸的合成中具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12P13/12, C12N11/10, C12R1/19, C12N1/21
【公开号】CN105200088
【申请号】CN201510662593
【发明人】杨波, 胡征
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月8日