一种检测dnmt3a基因突变的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种检测DNMT3A基因突变的引物与方 法。
【背景技术】
[0002] 急性髓细胞性白血病（Acutemyeloidleukemia,AML)是髓系造血干/祖细胞恶 性疾病。近年来，研究发现，在人类肿瘤疾病中，肿瘤相关基因会发生低甲基化或超甲基化 现象，即DNA甲基化模式的改变与肿瘤的发生发展有关。基因组甲基化模式的建立和维持 由DNA甲基转移酶（DNAmet的ltransferases，DNMTs)负责完成。在哺乳动物中，主要存在 3类具有催化活性的DNMTs，分别为DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和1个缺少甲基转移酶活性的类 似蛋白DNMT化。其中，DNMT3A和DNMT3B主要起从头甲基化作用，是肿瘤遗传机制的重要分 子。
[0003]目前有研究发现，DNMT3A基因丢失或发生突变导致造血干细胞的分化缺陷，据报 道，DNMT3A基因突变在AML患者中的发生频率为17. 8%-22. 1%，与野生型DNMT3A的AML患者 相比，DNMT3A基因突变患者往往为正常核型，并伴随NPM1、FLT3、imn等基因的突变。AML 患者的DNMT3A基因最常见的突变位点为R882(R882H，R882C，R882P，R882巧。因此，检测 DNMT3A基因的突变位点可W作为识别正常核型AML患者的预后指标。
[0004] 中国专利申请201310459210. 2公开了一种检测DNMT3A突变位点的方法、引物和 试剂盒，该试剂盒包括样品基因组DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系 反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，用于DNMT3A基因R882位点突变的检测存 在反应体系复杂和检测步骤复杂的缺点。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测DNMT3A基因突变的引物与 方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了DNMT3A基因外显子23突变的准确检 测。
[0006] 本发明提供一种检测DNMT3A基因突变的引物，包括针对DNMT3A基因外显子23的 上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGGAGTTGGTGGGTGTGAG(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAA CAGCTATGACCATGATGTCCAACCCTTTTCG(沈QIDNO. 2)。
[0007] 进一步地，所述引物中外显子23的上游引物和外显子23的下游引物浓度比为1 : 1〇
[000引另外，本发明还提供一种检测DNMT3A基因突变的方法，包括如下步骤：A)提取DNA样品；B)采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C)对扩增产物进行凝胶电泳分 析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。
[0009] 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。
[0010] 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :98°C3min;阶段2 :98°C 1〇3;阶段3:631：3〇3;阶段4:72°(：1111111;阶段5:返回到阶段2,34个循环；阶段6:721： 5min;阶段7 :25°C保溫。
[0011] 优选地，所述步骤c)中，采用Sequencher 4. 1. 4软件对检测结果进行分析。
[0012] 此外，本发明还提供检测DNMT3A基因突变的引物在制备检测DNMT3A基因突变试 剂中的用途。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测DNMT3A基因外显 子23突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了 一种检测DNMT3A基因外显子23突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏 度高、准确性好等优点，DNMT3A基因突变可W作为识别正常核型AML患者中的不同亚型的 预后指标，为临床用药提供指导。
【附图说明】
[0014]图 1 本发明提供的DNMT3A基因引物值NMT3A_R882_M13F&DNMT3A_R882_M13R)扩 增片段； 图2PCR扩增产物的凝胶电泳图； 图3DNMT3A基因外显子23 (野生型）的部分测序图； 图4DDNMT3A基因外显子23(c. 2645G〉A)的部分测序图。
【具体实施方式】
[0015] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
[001引实施例1、引物 发明人针对DNMT3A基因外显子23,设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比 较，筛选出了特异性好的引物。
[0017]表1本发明提供的引物
实施例2、引物的特异性检测 (1)将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting,引物对DNMT3A_R882_M13F/DNMT3A_R882_M13R扩增片段位于C虹2:25456954-25457431间，长度为478bp。没有其它同源基因， 与DNMT3A基因参考序列吻合。
[001引 （2)提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购 自Tiagen，货号：DP318)的说明书，将DM样品稀释至lOOng/化，备用。
[0019] PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购自肥B公司，货号：M049化），PCR 扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。外显子23的上游引物和外显子23的下 游引物浓度比为1 :1，外显子23的上游引物浓度和外显子23的下游引物浓度均为lOpmol/ Ulo
[0020]
对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示。结果显示，扩增产物的特异性高， 无非特异性扩增条带产生。采用Bi曲ye?Terminatorv3. 1(购自Life公司，货号4336919)。 [002。 对检测样本的PCR产物进行Sanger测序，具体Sanger测序的操作步骤如下： A)DNA测序模板处理，加入ExoSAP-IT酶，在ABI9700PCR仪中，下程序进行处 理：37 °C，15min; 80 °C，15min; 4°C，infinite。
[0022]B)参考Bi曲ye?Terminatorv3. 1 切cleSequencingKit操作说明制备测序 PCR体系。
[002引C)在ABI9700PCR仪中，按W下程序进行处理： 96°C，1min-（96°C，10sec- 50°C，5sec- 60°C，4min)，25 个循环一 4°C保溫D)用酒精/EDTA/NaAc法对测序PCR的产物进行纯化。
[0024] 巧室溫挥发净酒精，加入lOyL化-Di化rmamide溶解DNA，溶解后的样品需要在 95°C变性4min,迅速置冰中冷却4min后，上样电泳。
[0025] 测序结果显示，扩增片段与参考序列吻合（见图3和4)。
[0026] 实施例3、检测DNMT3A基因外显子23突变方法的准确性 本检测准确度定义为不同引物检测结果的一致性。
[0027] 本检测使用表4中的检测引物对22例血液样本DNA进行检测，所有DNA样本均使 用表4中的验证引物进行验证，结果如表5所示。22例样本经两套不同引物检测，检测结果 一致。本检测准确度为100%。
[0028] 表4本发明提供的验证引物
注：NMD即未检测到突变。
[0029] 实施例4、检测DNMT3A基因外显子23突变方法的特异性和灵敏度 本检测的检测特异性定义为阴性符合率，检测灵敏度定义为阳性符合率。
[0030] 本检测使用表1中的检测引物对22例血液样本DNA进行检测，所有DNA样本均使 用表4中的验证引物进行验证，结果如表5所示。
[0031] 两对引物检测结果为阴性（未检测到突变）的样本完全一致，本检测的检测特异 性为 100〇/〇。
[0032] 两对引物检测结果为阳性（检测到突变）的样本完全一致，突变位点及类型也完 全一致，本检测的检测灵敏度为100%。
[0033] 表6检测特异性及检测灵敏度
实施例5、检测DNMT3A基因外显子23突变方法的检测下限 (1)本检测采用Sanger测序法进行检测，建立Sanger测序平台时进行了相关验证，验 证结果表明，Sanger测序法的最低检测下限化0D)为20%，当突变细胞与正常细胞的比值低 于40%时，不排除假阴性的可能。
[0034]U)根据DNA输入量的检测结果显示，在DNA量输入范围12. 5~200ng/reaction 间，可保证突变样本检测结果一致。
[0035] 实施例6、检测DNMT3A基因外显子23突变方法的精密度 本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。
[0036] (1)批内精密度：本检测对1例阳性样本和1例阴性样本进行了DNMT3A基因外显 子23的3复孔检测。同一样本不同孔间的扩增均成功，Sanger测序结果如表7所示。结 果显示，同一样本不同孔间的检测结果一致。本检测的批内精密度为100%。
[0037] 表7批内精密度结果
注：NMD即未检测到突变。
[003引（2)批间精密度：本检测对7例样本进行了DNMT3A基因外显子23的S次检测。同 一样本不同批次的扩增均成功，Sanger测序结果如表8所示。结果显示，同一样本不同批 次的检测结果一致。本检测批内精密度为100%。
[0039] 表8批间精密度结果
注：NMD即未检测到突变。
[0040]因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的检测方法， 解决了DNMT3A基因外显子23突变的检测问题，可W作为预后指标识别正常核型AML患者 中的不同亚型，为临床用药提供指导，减少不良反应，在帮助指导用药和个性化治疗方面具 有重要意义。
【主权项】
1. 一种检测DNMT3A基因突变的引物，其特征在于，包括针对DNMT3A基因外显子23的 上游引物 TGTAAAACGACGGCCAGTAGGAGTTGGTGGGTGTGAG 和下游引物 CAGGAAACAGCTATGACCATG ATGTCCAACCCTTTTCG。2. 如权利要求1所述的检测DNMT3A基因突变的引物，其特征在于，所述引物中外显子 23的上游引物和外显子23的下游引物浓度比为1 :1。3. -种检测DNMT3A基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：A)提取DNA样品；B) 采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C)对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采 用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。4. 如权利要求3所述的检测DNMT3A基因突变的方法，其特征在于，所述步骤A)中的 DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。5. 如权利要求3所述的检测DNMT3A基因突变的方法，其特征在于，所述步骤B)中的 PCR扩增反应条件包括：阶段I:98°C3min;阶段2 :98°CIOs;阶段3 :63°C30s;阶段4 : 72°(：11^11;阶段5:返回到阶段2,34个循环；阶段6:72 1€51^11;阶段7:25°(：保温。6. 如权利要求3所述的检测DNMT3A基因突变的方法，其特征在于：所述步骤C)中，采 用Sequencher4. 1. 4软件对检测结果进行分析。7. 如权利要求1或2所述的检测DNMT3A基因突变的引物在制备检测DNMT3A基因突变 试剂中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测DNMT3A基因突变的引物与方法。本发明提供的检测DNMT3A基因突变的引物，包括针对DNMT3A基因外显子23的上游引物和下游引物。本发明提供的引物可以实现DNMT3A基因外显子23突变的特异性检测，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105200129
【申请号】CN201510608008
【发明人】梁耀铭, 于世辉, 赵薇薇, 燕启江, 胡昌明
【申请人】南宁金域医学检验所有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月23日