检测人类tert基因启动子突变的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别设及一种检测人类TERT 基因启动子突变的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 端粒酶（telomerase)是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转 录酶，与端粒的调控机理密切相关，起着维持细胞永生化和致癌的关键作用。端粒酶逆转录 酶（telomerasereversetranscriptase,TERT)是端粒酶的重要催化部分，TERT基因位于 人类第5号染色体，其中该基因的两个启动子突变位点，1，295, 2280T和1，295, 250OT(分 别称为C228T和C250T)尤为常见，运两种突变已被证实能够增强TERT启动子转录活性。 TERT启动子区突变不存在于正常的人类受试者及公共基因数据库，而表现为恶性肿瘤特异 性体细胞的遗传改变，因此对于运两种突变的检测在监测人类肿瘤发生的过程中发挥重要 作用。
[0003] TERT突变是原发性胶质母细胞瘤中出现频率较高（约为74. 2% )的基因突变之 一，在黑色素瘤、脂肪瘤、肝细胞癌、神经胶质瘤、膀脫癌等恶性肿瘤中都存在较高程度的 TERT启动子突变，最新研究显示：只携带TERT突变的III-IV级胶质瘤患者，其病理诊断结 果多为原发性胶母细胞瘤，且预后不良。因此，TERT突变为上述恶性肿瘤的发生和诊断提 供了一个生物标记，能帮助早期诊断肿瘤并帮助进行分子病理分类和预测脑瘤中枢神经系 统肿瘤的发生。目前，尚无对于TERT基因特定点突变的检测方法。现有TERT基因的检测 仅有通过原位杂交技术对TERT基因的表达进行分析的，该方法必须基于细胞形态学，且不 包含对TERT基因特定区域的扩增，因此只有当TERT基因总表达量显著升高或降低时，才能 用肉眼的方式观测到。
[0004] 巧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时定 量，是适合临床大规模使用的方法。染料法是巧光定量PCR中的常见方法，利用SYBRGreen 分子产生的巧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应体 系中加入了SYBRGreen染料分子。该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。与 邸的性能类似，SYBRGreen也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的巧光本底， 当反应体系中存在dsDNA时，SYBRGreen能特异性的与之结合并在497nm下激发。染料法 的优点：1、无需设计、合成探针，实验成本低；2、使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。染 料法的缺点：由于SYBRGreen与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除 了与特异性的祀序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特 异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采用该方法对于引物的 设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增，因此有必要 通过多个手段和方法来保证巧光信号的特异性。另外TERT基因启动子区域为非编码区，序 列中GC含量很高，因此片段扩增的难度很大。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术中的缺陷，同时实现对人类TERT基因启动子突变的检测 并计算样本的突变率，从而为肿瘤预后判断、祀向用药提供参考，本发明提供了一种检测人 类TERT基因启动子突变的方法及其试剂盒，该检测方法和应用该方法的试剂盒将特异性 引物用于巧光定量PCR方法中可W克服TERT基因启动子序列GC含量高、难W扩增等不利 条件影响，对C228T和C250T位点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1 %。
[0006] 一种检测人类TERT基因启动子突变的巧光定量PCR方法，包括W下步骤： 阳007] (1)在TERTC228T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组 DNA，形成C228T反应体系并进行巧光定量PCR扩增，和/或在TERTC250T反应混合液中加 入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行巧光定量PCR 扩增，还在TERT内标反应混合液中加入与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的 人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行巧光定量PCR扩增，其中：
[0008] 所述TERTC228T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 1所示序列的 TERTC228T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的TERTC228T反向引物和含 有巧光染料的PCR预混液；
[0009] 所述TERTC250T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的 16尺1'02501'前向引物、具有如序列表中569 10齡.4所示序列的161?1'02501'反向引物和含 有巧光染料的PCR预混液；
[0010] 所述TERT内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 5所示序列的TERT 内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 6所示序列的TERT内标反向引物和含有巧光染 料的PCR预混液；
[0011] (2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在C228T反应体系和/或C250T反应体 系进行巧光定量PCR扩增时的突变Ct值，然后确定与C228T反应体系和/或C250T反应体 系中相同的人类基因组DNA在内标反应体系的Ct值，对Ct值进行分析。
[0012] 一种检测人类TERT基因启动子突变的巧光定量PCR方法，其中：
[0013] 所述在TERTC228T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组 DNA为：在10yLTERTC228T反应混合液中加入5yL浓度为long/yL的人类基因组DNA， 其中：在TERTC228T反应混合液中TERTC228T前向引物、TERTC228T反向引物和含有巧 光染料的2XPCR预混液的体积比为（1-2) : (1-2) : (7-8)，优选为1. 25 :1. 25 :7. 5 ;在TERT C228T反应混合液中TERTC228T前向引物和TERTC228T反向引物的浓度均为2-6yM，优 选4-5uM，更优选4. 8uM;
[0014] 所述在TERTC250T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组 DNA为：在10yLTERTC250T反应混合液中加入5yL浓度为long/yL的人类基因组DNA， 其中：在TERTC250T反应混合液中TERTC250T前向引物、TERTC250T反向引物和含有巧 光染料的2XPCR预混液的体积比为（1-2) : (1-2) : (7-8)，优选为1. 25 :1. 25 :7. 5 ;在TERT C250T反应混合液中TERTC250T前向引物和TERTC250T反向引物的浓度均为2-6yM，优 选4-5uM，更优选4. 8uM;
[0015] 所述在TERT内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因 组DNA为：在14yLTERT内标反应混合液中加入1化、浓度为Wng/化、与C228T反应体 系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DM,其中：每14yLTERT内标反应混合液 中有TERT内标前向引物0. 3-0.TERT内标反向引物0. 3-0. 5iiL和含有巧光染料的 2XPCR预混液7-8yL不足14yL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14yLTERT内标反 应混合液中有TERT内标前向引物0. 3125yLTERT内标反向引物0. 3125yL和含有巧光染 料的2XPCR预混液7. 5yL;在TERT内标反应混合液中TERT内标前向引物和TERT内标反 向引物的浓度均为2-6yM，优选4-5yM，更优选4. 8yM。
[0016] 一种检测人类TERT基因启动子突变的巧光定量PCR方法，其中所述巧光定量 ?〇?方法的扩增过程为：（1)95°(：、3111111、循环数为1;(2)95°(：、153,68°(：、2〇3，循环数为18; (3)95°C、15s，57. 6°C、20s，循环数为 24 ;(4)升溫至 95°C。 阳017] -种检测人类TERT基因启动子突变的巧光定量PCR方法，所述对Ct值进行分析 的步骤为：
[0018]当样品在C228T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值17时，则该样品的 C228T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阔值，
[0019] 当样品在C250T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值22时，则该样品的 C250T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阔值，
[0020] 当样品在C228T反应体系的突变ct值小于阴性临界值17时，按照W下标准进行 判断：当该样品在C228T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值13时，则该样品的 C228T突变为阳性，即强阳；当该样品在C228T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值13时， 则计算C228T反应体系的ACt，ACt值=C228T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应 体系的Ct值，若反应体系的ACt值小于相应的ACt化t-off值11，则该样品的C228T突 变也为阳性，即弱阳，反之则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阔值，
[OOW 当C250T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值22时，按照W下标准进行判断：当 该样品在C250T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值19时，则该样品的C250T突变 为阳性，即强阳；当该样品在C250T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值19时，则计算该