自组装合成蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及合成蛋白支架的生成，该合成蛋白支架表现出有利于在使用合成蛋白 时向宿主免疫系统递送和呈递抗原的特异性功能和生物物理特性，即使所述抗原在宿主中 为免疫原性差的或为非免疫原性的，使得诱导宿主对抗原产生特异性抗体应答。描述一种 合成蛋白，该合成蛋白对哺乳动物免疫系统具有免疫原性，并且可组装成稳定的限定多聚 体。另外，描述一种方法，该方法用于使用所述蛋白质以向免疫原性差或非免疫原性的肽赋 予免疫原性并且诱导对这些肽的特异性抗体应答。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2013年3月15日提交的题为"Synthetic Self-Assembling Immunogenic Proteins"的美国专利申请序列号61/791，268的优先权，该专利以引用的方 式全文并入本文。
【背景技术】
[0004] 将外来（非自身）物质，即抗原，引入脊椎动物的免疫系统通常导致诱导宿主针对 该抗原的免疫应答。通常这将涉及B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的刺激，以及识别并且结 合至该抗原的免疫球蛋白分子（抗体）的产生。存在大量影响物质在宿主中诱导免疫应答 的程度的因素。当免疫系统演进并且发展成对"自身"无应答时，外来性的程度是重要的。 大小也是一个显著因素，较大分子大体上比较小分子更具免疫原性。低于约1000 Da分子量 的分子（分类为半抗原）太小，以致于无法以分离的形式被免疫系统发现，并且因此是非免 疫原性的，尽管这些分子仍具有抗原性。
[0005] 较大分子将更复杂，并且因此更可能含有多个免疫原性表位，并且还更易于被抗 原呈递细胞（APC)吞噬和处理。物质的组成也是重要的，其中蛋白质无疑为最具免疫原性 的。多糖的免疫原性小得多（以分离的形式），并且核酸和脂质基本上无免疫原性。类似 地，颗粒抗原或变性抗原比可溶分子和天然分子更具免疫原性。外来物质的暴露途径和生 物活性也可显著影响宿主的任何免疫应答的性质和程度。例如，与免疫系统的组分或细胞 相互作用的物质的肠胃外注射将导致比相对惰性或非活性物质的粘膜暴露（摄取/吸入） 更强的应答。
[0006] T细胞和B细胞以不同的方式识别外来抗原并且对外来抗原作出应答。特化的抗 原呈递细胞或APC (巨噬细胞、树突状细胞和B细胞）通过从细胞外空间吸收分子（包括大 分子和完整微生物）并且处理这些分子的蛋白内容物来连续地问询它们的环境。外源蛋白 由核内体的一组蛋白酶消化，并且所得肽显示在细胞表面上MHC II分子的沟槽中。这些肽 继而由T细胞表面上的专门受体（TCR)识别。T细胞发展的过程确保显示对含有自身肽的 MHC II作出反应的受体的那些T细胞耗尽，并且仅识别外来序列的那些T细胞成功地成熟。 T细胞识别的肽（T细胞表位）不变地是线性的，但是并不总是在肽来源的自然折叠蛋白质 上暴露或可触及。
[0007] 相比之下，B细胞表面受体或免疫球蛋白（BCR)识别可溶蛋白（构象表位或变性 表位）、半抗原、多糖，和较小程度上的一些脂质和核酸，并且主要与这些相互作用。BCR的 特异性与B细胞可分泌的抗体的特异性相同。在结合其同源抗原之后，BCR内在化，并且结 合的抗原经处理。只有当抗原是蛋白质，或连接到蛋白质组分时，抗原才会作为MHC II复 合物的一部分被呈递在细胞表面上。在这些条件下，B细胞然后可用于被具有识别呈递肽 的TCR的T辅助细胞刺激。就大的蛋白或复杂蛋白而言，B细胞可因此被许多不同的T细 胞活化，这些T细胞不一定必须识别与BCR相同的抗原表位，但是所有T细胞将识别相同蛋 白质的肽组分。脊椎动物免疫系统能够允许它们产生针对自身不具有免疫原性的抗原决定 子的抗体。
[0008] 为了开发有效疫苗，必须以这种方式将抗原表位呈递到宿主免疫系统，以刺激强 免疫应答，涉及T淋巴细胞和B淋巴细胞两者。不涉及效应子（辅助）T细胞的活化和B细 胞受这些效应子（辅助）T细胞的后续刺激的免疫应答通常持续时间短，并且不产生抗原记 忆，即当宿主第二次暴露于免疫原时，不引起更强力的且更快速的抗体应答。
[0009] 还常常需要引发能够抑制、阻断或以其他方式中和靶标的功能活性的抗体，并且 因此提供对宿主的保护的疫苗。出于许多原因，这会呈现一个大的挑战。很多情况下，需要 被抗体应答靶向的那些表位未得到鉴别，因为缺乏与该靶标相关的结构功能数据。即使当 存在与靶标和靶标相互作用相关的详细信息时，所鉴别的表位可能不是免疫显性的，并且 因此可能不产生在大多数患者中发现的应答。在其他情况下，关键保护性抗原决定子可能 不是蛋白质，例如病原体糖蛋白上的多糖，并且因此以分离形式不具免疫原性（T细胞依赖 性）。
[0010] 绝大多数疫苗通过胃肠外途径递送；但是粘膜递送存在许多优点，诸如患者的顺 从性、自身施用、感染风险的减小、以及诱导粘膜免疫和系统性免疫两者的可能性。还存在 许多要克服的障碍，诸如疫苗稀释、微菌群的存在、当口服给予时承受低PH以跨膜的需要、 和对有效佐剂的需要（Vajdy等人，2004)。此外，粘膜施用可引起B细胞耐受性而非免疫应 答。剂量也可对免疫应答具有主要作用。如果免疫原未被免疫系统有效清除，或如果系统 被过高剂量侵没，则可诱导耐受性。相反地，过低剂量也可引起耐受性，或简单地无法刺激 足够的免疫细胞。
[0011] 已发展多个方法以帮助克服这些困难。在大多数情况下，将疫苗与一些形式的佐 剂一起施用。佐剂基本上是当与免疫原一起施用时，引起以下情况中的一个或更多个的任 何制剂：注射位点处免疫原的持续、共刺激信号的增强、淋巴细胞增殖的非特异性刺激或肉 芽肿形成。佐剂具有多种形式，例如弗式完全佐剂由失活的分枝杆菌（Mycobacterium)组 成，而其他佐剂包含水包油（例如角鲨烯）乳液。这些最常用于动物中，因为它们可致使注 射位点处的不良反应。一些有机佐剂用于人类疫苗中，诸如Montamd# (基于植物组分 的矿物油），尽管更通常地，佐剂是无机佐剂，诸如铝盐。
[0012] 其中克服低免疫原性的最普及且广泛采用的方法是将鉴别的或期望的抗原或抗 原决定子与强免疫原性载体偶联。载体是来源于不同的物质的蛋白质或多肽，例如牛血清 白蛋白（BSA)和钥孔蛾血蓝蛋白（KLH)常常用作化学缀合的半抗原和小肽的载体以在动 物中产生抗体（Berzofsky和Berzofsky，1993)。载体在大到足够被宿主免疫系统发现并且 处理的分子上呈递半抗原，并且还通过具有固有免疫原性来刺激宿主免疫应答。
[0013] -般来讲，来源于在种系发生方面更远离接收者的来源的载体蛋白是较好的。然 后，载体可能更与宿主蛋白不同，并且因此更具外来性。选择载体蛋白时的另一个重要的考 虑因素是以下可能性，即如果该载体蛋白是宿主蛋白的同系物，并且因此分享显著的同源 性，则引发的免疫应答也可与宿主蛋白反应并且引起不良的副作用。非蛋白抗原仅可化学 偶联，这可限制对抗原连接在载体上的位置和抗原呈递方式的控制。小肽可化学上或基因 上偶联。在研究的其他区域，生物信息学的现代发展已引起免疫原，并且尤其是肽的合理设 计的提尚。
[0014] 肽疫苗的构思是基于B细胞和T细胞表位的鉴定和化学合成，这些表位是免疫显 性的并且可诱导特异性免疫应答，例如将靶分子的B细胞表位偶联到广泛识别的T细胞表 位以使该表位具有免疫原性（Naz R.K.和Dabir P.，2007)。当与较大和较复杂蛋白质抗原 比较时，可见肽相对易于产生。肽还可具有有利的化学稳定性，并且不含致癌或感染可能， 这使它们成为有吸引力的疫苗候选物。但是，若干障碍限制肽疫苗的普遍可用性，包括通常 它们的固有免疫原性低并且需要较好的佐剂和载体。其他研究提出，重组嵌合蛋白可制成 为更具免疫原性，若T辅助表位以串联重复序列的形式掺入（Kjerrulf M等人，1997)。
[0015] 另一类普及的载体蛋白是细菌类毒素。就针对细菌感染的疫苗而言，在感染的症 状由毒素的作用造成的情况下，那么这些毒素可用作疫苗本身。当然必须化学上地或通过 使用无毒的组分来使毒素无效。在20世纪发展的此类衰减的毒素例如白喉和破伤风疫苗 称为类毒素。诸如Wyeth(Pfizer)、Aventis Pasteur、GSK、Merck等公司的在使用或后期 发展中的多糖-蛋白质缀合物疫苗使用破伤风、白喉或其他类毒素。
[0016] 许多人已提出霍乱毒素或大肠杆菌（E. coli)热不稳定肠毒素（LT)的B亚基作 为各种疫苗应用的可用的载体蛋白（Nemchinov，L.G等人，2000 ;George-Chandy，A.等人 2001 ;美国专利6, 153, 203)。它具有高免疫原性，并且在不存在CT-A亚基的情况下是无毒 的。形成广泛使用的霍乱疫苗的基础，当全身性使用时，它被证实具有安全性。尽管相对小 (约12kDa)，但是它可组装成稳定的五聚体中，这为它提供较高的分子量。
[0017] 许多研究人员尤其感兴趣的是利用CTB和肠毒素五聚体对Gmi神经节苷脂的亲和 力，Gmi神经节苷脂是有核细胞的表面上发现的一种支链五糖。在霍乱感染期间，这种结合 促进全毒素跨肠上皮易位。在文献中存在大量报道，基于CTB融合（化学或遗传的）的疫 苗在口服或鼻腔内施用时可对刺激粘膜免疫有效（George-Chandy，A.等人，2001 ;Houhui Song 等人，2003 ;Shenghua Li 等人，2009 ;Harakuni，Α·等人，2005)。为了保持与 经 节苷脂（其在相邻CTB亚基之间形成的口袋处结合）反应的能力，必须的是，靶抗原不阻断 Gmi结合位点的进入并且不阻止CTB多聚体的组装。
[0018] 已证实，可对CTB进行遗传融合，此类遗传融合成功地保持Gmi结合，但是也存在限 制。Liljeqvist，S.等人（1997)示出，链状球菌蛋白G的血清白蛋白结合结构域可基因融 合到CTB的N末端或C末端，或同时融合到两个末端，并且保持Gmi结合。然而应指出，N末 端融合蛋白和双融合蛋白在形成稳定的五聚体方面效率显著较低，并且在结合至Gmi方面 不够有效。类似地，已证实，除非存在嵌合和野生型CTB两者的异种混合物，否则大的遗传 融合蛋白不能形成五聚体（Harakuni，A.等人，2005)。
【发明内容】
[0019] 根据本公开，由于合成载体的固有免疫刺激和类似佐剂的特性，合成载体的高免 疫原性性质能够提高宿主对所包括的可变序列的免疫应答。还公开根据本公开的合成载体 将使得宿主产生对至少部分地由可变序列编码的"自"抗原决定子的抗体应答。
[0020] 在一个例示性实施例中，重组合成蛋白能够组装成稳定的均五聚体，其中每个单 体包括一个或更多个来源于靶蛋白的抗原决定子。
[0021] 在另一个例示性实施例中，重组合成蛋白能够组装成稳定的杂五聚体，其中表达 不同的抗原决定子的单体组装在一起。
[0022] 在另一个例示性实施例中，重组合成蛋白基本上类似于以下序列：FTDIITDICGEYH NTQIHTLNDKILSYTESLVGKREIILVNFKGGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLSNSKIEKLCVWNN KTPHSIAAISMVR(序列 ID :1)
[0023] 在另一个例示性实施例中，重组合成蛋白包括接头或间隔区序列，由此定位在合 成载体的一个或两个末端处的可变序列以这样的方式与合成载体分开，其方式为使得若干 重组蛋白的合成载体元件缔合。在一个例示性实施例中，具有连接到生长因子的接头序列 的重组合成蛋白基本上类似于以下序列：
[0024] ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW