成人干细胞的体外扩增的制作方法
【专利说明】成人干细胞的体外扩增 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求2013年3月11日提交的美国临时申请No. 61/776, 422和2013年3 月12日提交的美国发明申请No. 13/795, 659的权益和优先权，将该临时申请和发明申请以 引用方式整体并入本文。 政府利益
[0002] 本发明是在美国国立卫生研究院（National Institute of Health)授予的编号 为5R44HL091740-03的政府资助下作出的。政府在本发明中具有某些权利。 序列表、表格或计筧机稈序表的引用
[0003] 本申请随电子格式的序列表一起提交。该序列表作为2014年3月10日创建的标 题为"106417-0182_5叫_1^5^.丨#"的文件提供，大小为101?字节。电子格式的该序列表 中的信息以引用方式整体并入本文。
技术领域
[0004] 本文提供涉及长期干细胞、产生这类细胞的方法以及各种蛋白质构建体的实施 例。
【背景技术】
[0005] 长期造血干细胞（LT-HSC)是存在于成人骨髓中并产生全部成熟红细胞组库的稀 有祖细胞。这些细胞对于所有红细胞区室的维持是必要的。在针对恶性血液病、自身免疫 性和免疫缺陷等的疗法中，干细胞移植可以是一种有用的辅助疗法。
【发明内容】
[0006] 在一些实施例中，提供一种产生条件性无限增殖化成人干细胞群体的方法。该方 法可包括向一种或多种成人干细胞提供外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多 者的Myc多肽和外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。在一些实施例中，该Myc多 肽以至少约72小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞并且该Bcl-2结构域多肽 以至少约96小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞，以产生条件性无限增殖化 成人干细胞群体。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不 超过每小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不 超过每两小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率 不超过每三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频 率不超过每四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的 频率不超过每五小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽 的频率不超过每六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多 肽的频率不超过每七小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每八小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每九小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每十小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每^^一小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该 Myc多肽的频率不超过每十二小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或 该Myc多肽的频率不超过每十三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/ 或该Myc多肽的频率不超过每十四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽 和/或该Myc多肽的频率不超过每十五小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域 多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结 构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十七小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2 结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十八小时一次。在一些实施例中，供应该 Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十九小时一次。在一些实施例中，供应 该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十小时一次。在一些实施例中， 供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二^^一小时一次。在一些实施 例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十二小时一次。在一 些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十三小时一次。 在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十四小时 一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每三十六 小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每 四十八小时一次。
[0007] 在一些实施例中，提供Myc融合蛋白。该融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促进细 胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽、V5结构域和六组氨酸表位标签。
[0008] 在一些实施例中，提供干细胞扩增培养基。该扩增培养基包含IL3、IL6、干细胞因 子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。
[0009] 在一些实施例中，提供Myc融合蛋白。该Myc融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促 进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。该Myc融合蛋白的半寿期超过约60分钟。
[0010] 在一些实施例中，提供编码本文公开的任何蛋白质的核酸。
[0011] 在一些实施例中，提供包含本文提供的任何核酸的载体。
[0012] 在一些实施例中，提供包含本文提供的任何载体或核酸的细胞。
【附图说明】
[0013] 各个实施例的特征在所附的权利要求书中以具体特征阐述。通过参考下文的"具 体实施方式"和附图，将获得对本发明一些实施例的特征和优点的更好的理解，在"具体实 施方式"中阐述利用各个实施例的原理的示例性实施例，而在附图中：
[0014] 图1A、1B、1C、ID和IE显示Tat融合蛋白的产生和体外表征的示例性实施例。图 IA显示Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的示意图的示例性实施例，包括HIV-ITat 的框内蛋白转导结构域及V5和6xHis标签的位置。图IB显示从大肠杆菌（E. coli)纯化、 经SDS-PAGE分离并用考马斯染色后的重组蛋白的示例性实施例。图IC显示暴露于纯化 的重组Tat-Myc、Tat-Bcl-2或保持未处理（NT)达两小时，然后用抗V5的单克隆抗体并用 Hoechst 9934核染剂固定和染色的汇合3T3细胞的菌苔的示例性实施例。Tat-Myc蛋白 在这个时间范围主要定位于核区域，而Tat-Bcl-2保持在细胞质和核周空间。图ID显示 经如下处理的源自人脐带血的HSC的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析（抗V5和β -肌动蛋白 的单克隆抗体）：利用Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏1小时，洗涤，然后裂解（在指定的 时间点）以将质膜和细胞质级分与核级分分离。图IE显示经如下处理的源自人脐带血的 HSC的核级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析（抗V5和β-肌动蛋白的单克隆抗体）：利用 Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏2小时，洗涤，然后裂解（在指定的时间点）以将质膜和细 胞质级分与核级分分离。该蛋白质的大部分在24小时至48小时之间失去。在72小时后 的任何时间点没有剩余可检测的蛋白质。
[0015] 图2A、2B、2C和2D显示表明重组Tat-Myc和Tat-Bcl-2具有生物活性的示意图的 示例性实施例。图2A和2B显示在单独培养基（无处理，NT)、补加有Tat-Cre (Tat对照， TC)或递增浓度的Tat-Myc(TM)(图2A)或Tat-Bcl-2 (TB)(图2B)的培养基中再次平板接 种48小时的体外活化T细胞的示意图的示例性实施例。还显示了起始细胞群体中的活细胞 的频率（浅灰色柱条）。图2C和2D显示进一步用Tat-Myc温育并用CFSE标记的活化T细 胞的示意图的示例性实施例，表明该活化T细胞保持母细胞化表型（blasting phenotype) (图2C)并且去除抗原刺激和外源添加的细胞因子后继续增殖（图2D)。
[0016] 图3A、3B和3C显示鼠 HSC在体外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增的示意图的示例 性实施例。图3A显示具有c-Kit+、Sca-I+表型并且呈现谱系标志物（Mac-1、Gr-1、B220、 ⑶3、Ter-119和Flk-2)阴性的所得细胞群体的FACS分析的坐标图的示例性实施例。图3B 显示与在没有添加 Tat融合蛋白的培养物中的HSC (浅灰色，最右边的迹线）相比，HSC在 体外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2进行培养时的增殖（深灰色，最左边的迹线）的示意图的示 例性实施例。图3C显示在具有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的培养物中体外细胞扩增的动力学 的示意图的示例性实施例。
[0017] 图4A、4B、4C和4D显示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增的鼠 Ptlt-HSC在体内的功 能分析的示意图的示例性实施例。几群经亚致死性辐照的Rag-I /小鼠被给予10 3个源自 从野生型C57BL/6J小鼠获得的骨髓细胞的ptlt-HSC。图4A显示与Rag-I /对照（第一小 图）相比，来自Ptlt-HSC嵌合小鼠（第二小图）的外周血中成熟B细胞的存在的FACS分 析（⑶19/B220表达）的示意图的示例性实施例。图4B显示与Rag-I /对照（第一小图） 相比，Rag-1 / ptlt-HSC嵌合小鼠（第二小图）的外周血中成熟T细胞的存在的FACS分析 (TCR β /⑶4表达）的示意图的示例性实施例。图4C显示来自Rag-1 / ptlt-HSC嵌合小鼠的 淋巴器官（脾脏、胸腺、淋巴结和骨髓）中的发育中的T细胞和B细胞的FACS分析（CD19/ IgM和CD8/CD4表达）的示意图的示例性实施例。图4D示出的数据证明成熟淋巴样细胞在 经它们的抗原受体活化后能够母细胞化并进行细胞分裂。
[0018] 图5A、5B、5C、ro和5Ε显示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增源自人脐带血细胞的HSC 的示意图的示例性实施例。图5A显示在体外扩增14天的人脐带血细胞的表面表型的FACS 分析的不意图的不例性实施例（顶部各小图仅用细胞因子混合物；底部各小图用补加有 Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物）。图5B显示在两组条件下⑶34+细胞的体外扩 增的动力学的示意图的示例性实施例。图5C显示源自人ptlt-HSC的、在甲基纤维素测定 法中在支持髓类红细胞分化的条件下发育的三种不同集落类型的图像的示例性实施例。图 显示在接种了 IO3个用细胞因子混合物培养的脐带血细胞（FCB)UO 3个用补加 Tat-Myc 和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物培养的脐带血细胞（FCB+TMTB)或IO4个新鲜的未经操纵 的脐带血细胞（ΚΓ4新鲜FCB)的甲基纤维素培养物中观察到的每种集落类型的定量的示 意图的示例性实施例。图5E显示再次平板接种图f5D中所示的细胞时在甲基纤维素培养物 中观察到的集落数目的定量的示意图的示例性实施例。
[0019] 图6A、6B、6C、6D、6E、6F和6G显示源自人脐带血的蛋白转导长期（ptlt)-HSC的 体内功能分析的示意图的示例性实施例。图6A显示几群被给予如下移植物的经亚致死性 辐照的NSG小鼠的骨髓的FACS分析的示意图的示例性实施例：106个在细胞因子混合物中 体外扩增的脐带血细胞（第一小图；FCB)，或IO6个在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞 因子混合物中扩增的脐带血细胞（第二小图；FCB TMTB)，或5X IO6个新鲜的未经操纵的 脐带血细胞（第三小图；新鲜FCB)。图6B显示来自异种嵌合小鼠的骨髓、脾脏和胸腺细胞 的FACS分析的示意图的示例性实施例。对所有细胞的人CD45进行染色。对CD45+细胞设 门，显示出骨髓中的人CD34+CD38lci细胞（第一小图；骨髓）；脾脏中的人CD19+和人CD3+ 淋巴细胞（第二小图；脾脏）；和胸腺中的人CD3+细胞（第三小图；胸腺）。图6C显示用 CFSE标记并在抗人CD40和IgM的单克隆抗体存在下培养的人脾脏B细胞的FACS分析的 示意图的示例性实施例。在NSG异种嵌合小鼠中发育的人B细胞在它们的抗原受体刺激后 发生增殖。图6D显示来自从NSG异种嵌合小鼠的骨髓获得并在甲基纤维素上平板接种的 人CD34+CD38lci细胞的髓类红细胞集落的定量的示意图的示例性实施例。图6E显示再次平 板接种后髓类红细胞集落的发育的定量的示意图的示例性实施例。图6F显示在细胞因子 混合物（空心圆圈）或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物（黑色正方形）中 体外扩增的CD45阳性骨髓细胞群体中的髓样细胞和淋巴样细胞分化（CD 11b、CD33、CD3和 ⑶19表达）的定量的示意图的示例性实施例。图6G显示在细胞因子混合物（空心圆圈） 或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物（黑色正方形）中体外扩增的⑶45阳 性脾脏细胞群体中的髓样细胞和淋巴样细胞分化（⑶11b、⑶33、⑶3和⑶19表达）的定量 的示意图的示例性实施例。
[0020] 图 7A、7B、7C、7D、7E、7F 和 7G 显示用 Tat-Myc 和 Tat-Bcl-2 体外扩增成人 G-CSF 动 员的HSC的示意图的示例性实施例。图7A显示人CD45+细胞的表面表型的示意图的示例性 实施例，表明了人⑶34+级分和⑶38+级分的富集。图7B显示在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存 在下在培养物中进行体外细胞扩增18天时间的动力学的示意图的示例性实施例。图7C显 示表明了 5X103个用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在体外扩增的成人G-CSF HSC在甲基纤维素中 产生4种形态学上不同的集落类型的示意图的示例性实施例。图7D显示表明了用Tat-Myc 和Tat-Bcl-2在体外扩增的成人G-CSF HSC在异种嵌合NSG小鼠中产生人造血谱系的FACS 分析的示意图的示例性实施例。骨髓来自移植了用补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因 子混合物（第一小图；G-CSF+TMTB)或用新鲜的未经操纵的脐带血细胞（第二小图；新鲜 FCB)扩增的ptlt-HSC的NSG小鼠。图7E显示来自骨髓、脾脏和胸腺的细胞的FACS分析 的示意图的示例性实施例。骨髓细胞包括人CD45细胞（它们也是人CD34+和CD38+)(第 一小图）、脾脏细胞包括人CD45细胞（也对它们的人CD3进行染色）（第二小图）；胸腺细 胞包括人⑶45细胞及⑶3 (第三小图）。图7F和7G显示对植入了 IO6个在补加 Tat-Myc 和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中（黑色正方形）体外扩增的G-CSF动员细胞的一群异种 嵌合小鼠进行髓样细胞和淋巴样细胞分化评估的示意图的示例性实施例。对骨髓细胞（图 7F)和脾脏细胞（图7G)的⑶45阳性群体分析⑶11b、⑶33、⑶3和⑶19表达。
[0021] 图8显示用CFSE标记并分别在抗小鼠⑶3或⑶40和IgM的单克隆抗体存在下培 养的小鼠脾脏T细胞和B细胞的FACS分析的示意图示例性实施例。在移植了来自5FU处 理的C57BL. 6的扩增HSC的Ragl-/-小鼠中发育的小鼠 T细胞（第一小图，最左边的浅灰 色线条）和B细胞（第二小图，最左边的浅灰色线条）与未经刺激的细胞（最右边的深灰 色线条）相比，在它们的抗原受体刺激后发生增殖。
[0022] 图9A和9B显示各种Myc融合蛋白构建体在活化T细胞活力测定中的活性的示例 性实施例。图9A显示一些代表性的Myc融合蛋白构建体的示例性概略性比对。图9B显示 在用代表性的Myc融合蛋白构建体处理后48小时活T细胞百分数的示意图的示例性实施 例。
[0023] 图10A、10B、IOC和IOD显示各种Tat融合蛋白（各为50 μ g/ml)在活化T细胞活 力测定中的活性的示例性实施例。图IOA显示来自未经处理的细胞（无处理）的FACS分 析（前向和侧向散射）的活门（live gate)的示意图的示例性实施例。图IOB显示来自经 Tat-Cre处理的细胞（Tat-Cre对照）的FACS分析（前向和侧向散射）的活门的示意图的 示例性实施例。图IOC显示来自经Tat-Bcl2处理的细胞（Tat-Bcl2)的FACS分析（前向 和侧向散射）的活门的示意图的示例性实施例。图IOA显示来自经Tat-Myc处理的细胞 (Tat-Myc)的FACS分析（前向和侧向散射）的活门的示意图的示例性实施例。
[0024] 图11显示在多种细胞因子存在下并且在有或没有PTD融合蛋白的情况下扩增的 CD34+细胞的数目的示意图的示例性实施例。
[0025] 图12显示来自接受了 5ΧΚΓ6个在单独FCB培养基（顶部小图）或补加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培养基（左下小图）中扩增的细胞的NSG小鼠的、对人⑶45染 色的骨髓细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2 处理的细胞的小鼠中人CD45+细胞的增加。CD45+细胞进一步通过流式细胞术进行分析以 确定CD34阳性细胞的存在（右下小图）。
[0026] 图13显示来自接受了 5ΧΚΓ6个在单独FCB培养基（顶部小图）或补加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培养基（左下小图）中扩增的细胞的NSG小鼠的、对人⑶45染 色的脾脏细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2 处理的细胞的小鼠中人CD45+细胞的增加。CD45+细胞进一步通过流式细胞术进行分析以 确定CD19和CD3阳性细胞的存在（右下小图）。
[0027] 图14显示来自接受了 5ΧΚΓ6个在单独FCB培养基（顶部小图）或补加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培养基（左下小图）中扩增的