基因组测序和表观遗传分析的方法
【专利说明】基因组测序和表观遗传分析的方法发明领域
[0001]本发明涉及基因组测序和表观遗传分析的方法。
[0002]背景
[0003]染色质的表观遗传状态调控转录因子和复制机构对DNA的接近。在真核生物中，调控细胞的表观遗传状态的因素例如为DNA的甲基化作用和对组蛋白的共价修饰。下一代测序的发展已使得有可能使用染色质免疫沉淀法(ChlP-seq)来获得整个基因组的表观遗传修饰的概况。ChlP-seq允许对结合至基因组的特定区域的蛋白质进行高分辨检测，并且ChlP-seq可用于准确定位在细胞内导致表型改变的表观遗传修饰。
[0004]表观遗传修饰是指对特定DNA序列和其相关组蛋白进行可逆的共价修饰。这些可逆的共价修饰影响如何利用基础DNA，并因此还可控制性状(Jenuwein和Allis (2001)Science，293，1074-1080 ;Klose 和 Bird(2006)Trends In B1chemical Sciences, 31,89-97)o
[0005]对哺乳动物基因组的表观遗传修饰包括甲基化、乙酰化、核糖化、磷酸化、SUMO化修饰(sumoylat1n)、瓜氨酸化(citrullinat1n)和泛素化(ubiquitylat1n)。这些修饰可在核小体内的4个核心组蛋白的超过30个氨基酸残基上发生。例如，对哺乳动物中DNA的大多数常见表观遗传修饰是对DNA的甲基化和羟甲基化，这两者皆可在胞嘧啶嘧啶环的第5个碳上进行。
[0006]对基因组的表观遗传修饰可如基因组诱变一般深刻地影响发育和健康。特定而言，上文所述的表观遗传修饰不改变一级DNA序列。相反地，该表观遗传修饰对基础DNA如何表达具有有效影响。因此，表观遗传修饰可如DNA序列中的突变一般有力地改变表现型。
[0007]例如，pl6肿瘤校正基因的突变(S卩，核苷酸序列中的突变)使该基因沉默。类似地，在P16肿瘤校正基因的启动子上的DNA甲基化(S卩，核苷酸序列无突变)使该基因沉默。这两个事件(即，核苷酸序列的突变和正确序列的甲基化)皆有助于结肠直肠癌的发生和进展。然而，与永久性突变不同，P16的表观遗传沉默在药理学上可逆。因此，检测出表观遗传修饰的能力提供一种用于医疗干预和直接治疗方案的途径。
[0008]全基因组(genome wide)发生的特定表观遗传修饰也在发育期间调控细胞分化(Mikkelsen等人(2007)Nature，448，553-U552)。例如，成熟组织中的表观遗传修饰有助于癌症和其他疾病的引发和进展(Feinberg，A.P.(2007)Nature，447，433-440)。另夕卜，研究已表明表观遗传修饰受到环境变量的影响，所述环境变量包括饮食(Waterland和 Jirtle (2003) Molecular And Cellular B1logy，23，5293-5300)，环境毒素(Anway等人(2005)Science，308，1466-1469)以及母性行为(Weaver 等人(2004)NatureNeuroscience，7，847-854)。考虑到表观遗传修饰在正常发育、环境响应、疾病发生和疾病进展中起到的基本作用，需要研发对基因组DNA进行测序以检测表观遗传修饰的方法。特定而言，需要研发对基因组DNA进行测序来从可由简单活检或组织样本获得的小数量细胞中检测出表观遗传修饰的方法。
[0009]此外，即使表观遗传修饰未由DNA序列的改变组成，所述表观遗传修饰仍可在有丝分裂期间从母细胞传递给子细胞，并且可从一代到下一代经由减数分裂持续传播。因此，即使表观遗传修饰可远比DNA序列的改变更容易地改变并回复其初始状态，但其仍对发育和疾病很重要。
[0010]因为表观遗传修饰涉及癌症发展和癌症进展，已对其进行格外研究。例如，与对人结肠直肠癌发展进行DNA甲基化时的扰动相关的早期观察以及后续研究表明DNA甲基化状态的实验操作在药理学或遗传学上有能力控制肿瘤发展。因此，愈来愈多研究表明针对表观遗传状态修改的治疗可控制癌症和疾病进展。同样地，可针对疾病状态对表观遗传修饰进行定位，并且表观遗传修饰可用作生物标志物来检测或预防疾病发生和进展。
[0011]表观遗传修饰的其他实例为响应于有机体环境而发展的那些表观遗传修饰(例如，人类生活的地方以及在周围环境中人类所暴露于的具体内容可能影响表观遗传修饰)。影响表观遗传的环境因素的实例包括养育期间的母性行为、暴露于内分泌干扰物以及食物的营养构成。此外，如上所述，表观遗传修饰和所得表现型可从父母传播给后代，即便仅父母而非后代暴露于所述环境因素。这引起以下可能:家族中存在的一些复杂性状(如肥胖、癌症或行为模式)通过表观遗传修饰来传播，并且所述复杂性状是由前代所经历的暴露环境因素所导致。
[0012]分析染色质的表观遗传修饰的现有方法，诸如染色质免疫沉淀法(ChIP)，是劳动密集性的并且需要系列过程，所述系列过程对分析通量和样本数量构成显著限制。
[0013]ChIP涉及免疫沉淀法，其使用对所关注表观遗传修饰具有特异性的抗体来分离经过修饰的染色质，该染色质随后用大规模平行DNA测序(ChlP-seq)、微阵列杂交或基因特异性PCR来分析。ChIP可用于表征染色质相关蛋白质的基因组分布(genome placement),并且是目前实践用于表观遗传和染色质研究的主要分析工具。然而，其具有较大局限。首先，该分析一般需要至少17个细胞。换句话说，当细胞数目有限时，目前的ChIP方法需要的细胞远多于可用的细胞。例如，不可能在胚胎上、在体外培养中未繁殖的初级细胞上、在显微切割细胞上以及在从活体动物诸如人类的活检中直接获取的小细胞样本上执行ChlP-seq。因此，表观遗传测试的目前方法涉及巨量细胞分析(即，平均至少16个细胞)。
[0014]单个哺乳动物细胞中RNA和DNA的全基因组测序对以精确度揭示全面转录计划(global transcript1nal program)和DNA变异来说拥有巨大前景。然而，重要的缺失环节是该基因组在从组织分离的小数量细胞(例如小于16个细胞，例如I个至20，000个细胞之间)中的表观遗传和转录因子结合性图谱的信息。获得用于深度测序的DNA所需的多个步骤限制了染色质免疫沉淀法(ChIP)的应用，因为深度测序通常需要不能利用传统ChIP方法采集的大数量DNA (即，因为ChIP需要大量纯化步骤，通常损失大数量DNA)。
[0015]本文所述的是一种基于DNA强化回收的新方法。特定而言，本文提供的方法描述通过添加保护剂以及有利的DNA扩增(RepFamp)来在ChIP期间加强DNA回收(S卩，防止纯化和加工步骤中的DNA损失)。所述方法允许在极小数量的细胞中对表观遗传图谱进行稳健且可靠的定位，并且产生一种不用细胞计数来揭露表观遗传改变而进行全面转录组分析的新型和新颖方法。
[0016]发明概述
[0017]本发明涉及对来自细胞的样本的基因组DNA进行测序的方法，并且所述方法包括:对细胞的所述样本中的染色质进行断裂；将载体DNA加入细胞的所述样本的所述断裂染色质中，其中所述载体DNA (称为“DNA1 ”)是5’生物素化DNA ;使载体DNAl和断裂染色质的混合物沉淀；使阻断引物退火，所述阻断引物防止DNA扩增并且与所述DNAl互补；对来自细胞的样本的基因组DNA进行扩增；以及对扩增DNA进行测序。在I个至20，000个细胞的细胞样本上执行所述方法。
[0018]本发明涉及对来自细胞的样本的基因组DNA进行测序的方法，并且所述方法包括:对细胞的所述样本中的染色质进行断裂；将载体DNA (称为“DNA2”)加入细胞的样本的断裂染色质中，其中所述载体DNA被5’悬突和3’间隔物3修饰进行5’生物素化；使载体DNA2和断裂染色质的混合物沉淀；使来自细胞的样本的基因组DNA扩增；以及对扩增DNA进行测序。在I个至20，000个细胞的细胞样本上执行所述方法。
[0019]本发明涉及对来自细胞的样本的基因组DNA进行测序的方法，并且所述方法包括:将细胞的样本与一大批增量细胞组合；对样本细胞和增量细胞中的染色质进行断裂；使细胞的断裂染色质沉淀；使来自细胞的所述样本的所述基因组DNA扩增；以及对扩增DNA进行测序。在I个至20，000个细胞的细胞样本上执行所述方法。
[0020]附图简述
[0021]图1示出对(I)经由保护来回收(RePro)与(2)经由保护和有利扩增来回收(RePam)进行比较的草图表示。为了 RePro和RePam，将诸如DNA的保护低聚物加入样本细胞以用于ChIP DNA分离、全基因组DNA分离、或RNA分离。在RePro方案中，载体DNA和样本DNA两者皆将扩增(无偏向)，这需要增加测序深度。在RePam中，所用的特异性载体测序或PCR引物抑制载体DNA的扩增，同时允许所关注DNA的扩增。该有偏向扩增降低所需的测序深度。测序之后，将使用软件来过滤载体DNA的读数以产生所关注DNA的读数。
[0022]图2示出列出载体DNA的许多可能类型中三个类型(来自啤酒酵母(S.cerevisia)或大肠杆菌(E.coli)、或合成寡聚DNA的基因组DNA)的图表，所述载体DNA来自果绳、小家鼠和人类并且在黑尾果绳(Drosophila melanogaster)、小家鼠(Musmusculus)和智人(Homo sapiens)的基因组研究中具有使用潜力。列出了在可定位至所关注基因组的载体DNA中的短序列标签的数量。理论上的短序列标签长50bp，涵盖Ibp步长的载体DNA，并且利用允许3个失配的蝴蝶结(bowtie)来定位至所述靶基因组。来自其他物种的基因组DNA的使用允许RePro，同时合成DNA的使用允许RePro和RePam两者。RePam通过阻断载体DNA的扩增而提供对所关注DNA的有利扩增，并且减小定位所需的测序深度。
[0023]图3示出两种类型的载体DNA。图3A示出载体DNAl。载体DNAl为具有已知序列的生物素化DNA。图3B示出载体DNA2。载体DNA2含有与DNAl中相同的生物素化DNA，以及在两端皆含有额外的5’悬突和3’间隔物3修饰。该末端结构对DNA聚合酶填充所述悬突进行阻断，因此用于PCR的衔接子DNA不能连接这些末端，并且不能发生扩增。
[0024]图4示出在存在和不存在扩增阻断剂的情况下载体DNAl的PCR扩增图表。所述载体DNAl为如图3A所示的生物素化双链DNA。扩增阻断剂为在5’端携带所示修饰的寡聚DNA。生物分析仪曲线图显示随着标准文库构建程序中扩增阻断剂浓度增加，对载体DNAl扩增的阻断增加。红色箭头指示扩增载体DNAl的峰。
[0025]图5示出对载体DNA2的PCR扩增阻断的演示。载体DNA2为图3B所示的具有3’修饰的生物素化双链DNA。此类DNA不能连接至用于文库构建的PCR引物，因此，其不能扩增，如通过在利用标准文库构建程序进行PC