一种肽适体及其作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质工程领域，具体地说，设及W葡萄球菌核酸酶为基本骨架的肤 适体及其在水稻稻攝病防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 稻攝病、白叶枯病和纹枯病被列为水稻=大主要病害。稻攝病是由稻攝霉 (Magnaporthegrisea)引起的水稻真菌性病害，分布范围十分广泛，90年代W来，我国稻 攝病的年发生面积均在5700万亩W上，年损失稻谷达数亿公斤。稻攝菌侵染过程依赖多种 信号通路参与调控，其中Ca2+信号通路在稻攝菌的生长发育、抱子萌发、侵染结构形成和致 病性方面也具有重要作用。巧调蛋白（Calmo化lin，CaM)是Ca2+信号通路中的重要组成部 分，尤其与稻攝菌抱子萌发和附着胞形成密切相关。
[0003] 巧调蛋白括抗剂是W巧调蛋白为祀点的药物，对研究巧调蛋白在稻攝菌致病性方 面的功能具有重要意义。但是，目前市场上巧调蛋白括抗剂均专一性不强，且无任何稻攝菌 巧调蛋白括抗剂的研究报道，使得巧调蛋白括抗剂不仅于稻攝菌巧调蛋白，还会影响其他 的通路蛋白，无法实现单一变量的实验策略。
[0004] 肤适体（P巧tideaptamer，P巧aptemers)是人工合成的随机氨基酸文库中筛选 出的可特异性、高亲和力结合祀标的短肤。其主要结构包括一段无生物活性的支架蛋白 (scafToldprotein)W及两端固定在支架蛋白上的可变肤段。肤适体文库的设计原理是 将大量人工合成的随机肤序列，插入、整合于蛋白支架之上构成肤库，利用随机区域的信号 基序（signalmotif)与祀蛋白之间的相互作用，筛选得到针对祀蛋白的高亲和力、高特异 性的肤适体。本实验室拥有库容量约为1. 5-2.OXIO7的肤适体文库：肤库为可编码16个 随机氨基酸的寡核巧酸文库，W改造的葡萄球菌核酸酶S化Se(Staphylococcalnuclease, SN)为脚手架蛋白，借助两端限制性酶切位点，成功将随机片段插入至挪ase中。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能够作为稻攝菌巧调蛋白括抗剂的肤适体及其应用。
[0006] 本发明提供的肤适体，其为SNP-D4,W葡萄球菌核酸酶为基本骨架，具有：
[0007] 1)沈QIDNo. 1所示的氨基酸序列；或
[0008] 2)SEQIDNo. 1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸。
[0009] 本发明提供了编码上述肤适体的基因，其具有：
[0010] DSEQIDNo. 2所示的核巧酸序列；或
[0011] 2)SEQIDNo. 1所示核巧酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核巧酸；或
[0012] 3)在严格条件下与1)限定的核巧酸序列杂交的核巧酸序列。
[0013] 含有上述编码肤适体的基因表达载体属于本发明的保护范围。
[0014] 含有前述表达载体的宿主细胞属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明提供了含有肤适体SNP-D4的生物制剂。
[0016] 本发明提供了含有肤适体SNP-D4的稻攝菌巧调蛋白括抗剂。
[0017] 本发明还提供了含有肤适体SNP-D4的农药。
[0018] 本发明提供了肤适体SNP-D4在植物保护方面的应用和在抑制稻攝菌中的应用。
[0019] 本发明提供了含有肤适体SNP-D4的生物制剂在在植物保护方面的应用和在抑制 稻攝菌中的应用。
[0020] 本发明提供了含有肤适体SNP-D4的农药在植物保护方面的应用和在抑制稻攝菌 中的应用。
[0021] 本发明提供了肤适体SNP-D4在制备抑制稻攝菌的生物制剂或农药中的应用。
[0022] 本发明提供了肤适体SNP-D4在制备转基因植物方面的应用。
[0023] 本发明具有下列优点及有益效果：
[0024] 本发明提供的肤适体SNP-D4(氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示，核巧酸序列如SEQ IDNo.2所示）既能与CaM特异性相互作用、又具有抑制稻攝菌抱子发育功能，可作为稻攝 菌巧调蛋白括抗剂在植物保护、抑制稻攝菌生长方面具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[00巧]图1为稻攝菌CaMPCR扩增产物1 %琼脂糖电泳图，其中M为DS5000Marker;1为 空白对照，2为稻攝菌CaM。
[0026] 图2为显微镜下SNP-D4抑制稻攝菌生长的观察图。WPBS和挪ase处理组为阴 性对照，1% =环挫处理组为阳性对照，显微观察各组解育化、3h、化后抱子萌发及芽管形 成的差别。
【具体实施方式】
[0027]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0028]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0029] 大肠杆菌E.COliXLl-BlueMRF'、E.COliXLl-BlueMR为实验室保存菌种。质粒 地T、pTRG、PBT-LGF2、pTRG-Galllp为实验室保存质粒。肤适体文库pTRG-SNP由本实验室 构建。表达质粒祀T32a-CaM已在文献（马志斌，刘静，张红玉，王立安.稻攝病菌巧调 素基因的克隆及原核表达特性研究.中国植物病理学会2008年学术年会论文集.2008. 5 月：249-253页）中公开。稻攝病菌菌株Magnaportheoryzae为实验室保存菌株。
[0030] 实施例1稻攝菌CaM基因的克隆 [00引]1、引物设计
[0032] 根据稻攝菌CaM核酸序列，使用PrimerPremier5.0和DNAMAN软件设计上下游 引物（如表1所示），由上海生工生物工程股份有限公司合成。
[003引 表1稻攝菌CaMPCR扩增引物
[0034]
[0035] 2、PCR扩增
[003引 PCR反应体系巧0 iU):
[0038] ?〇?反应程序：94°(：，3111111;941：303,631：453,721：453，共30个循环，72°(：10111111。 PCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
[0039] 3、PCR产物回收
[0040] 利用PCR产物纯化试剂盒（上海捷瑞）进行PCR产物纯化回收，电泳检测回收的 DNA片段。
[0041] 4、"诱巧"重组质粒的构建
[0042] 4. 1 酶切
[004引 （1)稻攝菌CaM基因片段双酶切
[0044] ①稻攝菌CaM基因片段，酶切体系如下：
[0045]
[0046] ②37 °C酶切化。纯化，溶于30yITE缓冲液。
[0047] 似"诱巧"表达载体地T双酶切 [004引①地T载体双酶化体系如下：
[0049]
[0050] ②37°C酶切化，取0.加1 1XCIP处理30min。回收、纯化，溶于30y1TE缓冲液。
[0051] 4. 2连接反应
[005引按照载体/基因片段摩尔比为1:3或者1:4,使用T4DNAligase进行连接反应，反 应体系（10iU)如下；
[0053]
[0054]
[00巧]16°C处理4h后，存放于-20°c用于后续实验
[0056] 4. 3XL1-BLUEMRF'感受态细胞的制备
[0057] 采用化Clz法制备化I-BL肥MRF'大肠杆菌感受态细胞。
[005引4. 4热激转化
[0059] (1)向大肠杆菌XLl-BL肥MRF'的化化感受态细胞中加1y1重组质粒DNA，轻 轻摇匀，冰上放置30min;
[0060] (2) 42°C水浴热激90s，立即放入冰上冷却2min;
[0061] (3)加SOOul LB液体培养基，37°C摇床溫育1-化；
[0062] (4)取 200ul菌液涂布于Cam/IPTG/X-gal平板上，37°C培养 12h。
[0063] 4. 5阳性克隆的筛选
[0064] 挑取Cam/IPTG/X-gal平板上长出的白色菌落划线，37°C培养12h。
[0065] 4.6菌落PCR验证阳性克隆
[0066] 分别采用CaM上下游引物CaM-F/CaM-R和地T载体上游引物地T-F 5'TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC3'与CaM下游引物CaM-R两对引物对阳性克隆进行菌落PCR验 证。
[0067]PCR验证体系①：细菌裂解上清 1y1，CaM-FO. 5y1，CaM-R0. 5y1，2XPCRmix 6y1，(1地2〇 4y1，总体积 12y1。
[0068]PCR程序：94°CSmin;94°C30s, 63°C45s, 72°C45s,共 25 个循环；72°ClOmin。
[0069]PCR验证体系②：细菌裂解上清Iy1，pBT-F0. 5y1，CaM-RO. 5y1，2XPCRmix 6yI，(1地2〇 4yI，总体积 12yI。
[0070]PCR程序：94°CSmin;94°C30s, 57°C45s, 72°C45s,共 25 个循环；72°ClOmin。 [007。 选用引物CaM-F/R，W质粒祀T32a-CaM为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳 检测PCR产物，如图1所示，在分子量450bp处出现一条与预期分子量大小一致的目的片 段。将获得的阳性克隆送往生工生物工程有限公司进行测序，测序结果见SEQIDNO. 3。将 pBT-CaM测序结果进行NCBI-BLAST分析化ttp://www.nicbi.nlm.gov/)。结果显示，测序 结果与NCBI数据库中的稻攝菌巧调蛋白（Calmcxlulin，CaM)基因序列（GenBanK序列号： FJ865430. 1)匹配率为100%。由此说明，"诱巧"重组质粒地T-CaM构建成功。
[0072] 实施例2对稻攝菌抱子具有抑制功能的肤适体的筛选
[0073] 1、细菌双杂交筛选特异性肤适体
[0074] (1)37°C预热SOC培养液，并于-20°C预冷电转杯和1. 5ml离屯、管若干；
[0075] 似取出-80°C保存的XLl-BLUEMRF'甘油感受态细胞于冰上解冻15min左
[007引做设置电转化参数（电压1.化V，电阻400Q，电容25y巧；
[0077] (4)添加50ng实施例1获得的诱巧质粒地T-CaM和50ngpTRG-SNP肤适体文库。 该肤适体文库构建方法为：
[007引 1)提取葡萄球菌基因组分别用5SNA及3SNA，5SNB及3SNB进行PCR，用对应酶切， 连接到载体pTRG上，构建成pTRG-SN。
[0079] 5SNA: 5'-GGATCCGCGGCCGCAATGGGTTACCCATACGACGTTC-3' 度amHI位点）
[0080] 3SNA:5'-GTACTTA