一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核特异性细胞因子的融合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术中的蛋白领域，具体涉及一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核特异性细胞因子的融合蛋白。
【背景技术】
[0002]结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，近年来随着流动人口增加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株的出现，使全球结核病疫情增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。全世界约有1/3的人口感染结核杆菌，每年新发结核病人约900万，每年约有300万人死于结核病，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。
[0003]结核分枝杆菌是一种典型的胞内感染菌，机体对其免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫。结核分枝杆菌通过呼吸道进入肺部，定植于肺泡巨噬细胞，逃逸宿主免疫防御机制；同时，原肺泡中未活化的树突状细胞(Dendritic cells, DC)抗菌活性弱，但可将结核分枝杆菌吞噬并迀移到其他组织，通过MHC将抗原提呈于T淋巴细胞导致其活化，活化的T淋巴细胞可产生多种细胞因子(INF-γ、IL-2与TNF-α等)，这些细胞因子可激活其他免疫细胞，并共同作用于病灶中的结核分枝杆菌。根据这一免疫机制，通过对已感染结核分枝杆菌的患者及健康人血液中的细胞因子进行分析对比，发现感染结核分枝杆菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-α的浓度明显升高。
[0004]使用体外诱导外周血单个核细胞(PBMC)产生结核相关细胞因子是目前诊断结核病的主要方式。外周血是人类免疫系统研究的主要对象，其中的PBMC包括淋巴细胞(Τ淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞)、单核细胞和树突状细胞。将已经感染了结核分枝杆菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用结核相关抗原对其进行刺激，PMBC即可对抗原发生免疫反应，产生相应的细胞因子。由于直接使用结核分枝杆菌进行实验具有相当的危险性，不利于进行大量研究，因此研究人员采用提取的结核分枝杆菌抗原蛋白进行研究实验。
[0005]结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质。pro可以刺激T细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子，但对于已经经过卡介苗(BCG)免疫个体的样本，PPD同样能够刺激其提取出来的PBMC产生结核相关细胞因子，因此PPD的特异性较低，还需寻找特异性更好的刺激物。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，寻找特异性更好的刺激物，本发明的目的在于提供一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核特异性细胞因子的融合蛋白及其应用。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种融合蛋白，包含CFP-10、ESAT-6和EspC三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。
[0008]优选的，连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。
[0009]优选的，CFP-10、ESAT_6和EspC蛋白为全序列蛋白或表达抗原活性的部分功能区域多肽。
[0010]优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC、CFP-10-连接肽-EspC-连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-CFPlO-连接肽-EspC、ESAT6-连接肽-EspC-连接肽-CFP10、EspC-连接肽-CFP-10-连接肽-ESAT-6或者EspC-连接肽-ESAT-6-连接肽-CFP-10。
[0011]优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC。
[0012]优选的，融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0013]优选的，编码融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC的核酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0014]上述任一项所述的融合蛋白能够诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白。
[0015]上述任一项所述的融合蛋白作为结核病检测抗原的应用。
[0016]上述任一项所述的融合蛋白在结核病预防治疗中作为刺激物的应用。
[0017]本发明的有益效果是:
I)本发明提供了一种可以刺激PBMC产生结核相关细胞因子的融合蛋白，与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。在本发明融合蛋白的作用下，PBMC可高效产生结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等结核相关因子，并且这一刺激诱导反应不受BCG (卡介苗)的干扰。
[0018]2)本发明选用的连接肽链为经过设计、筛选的可以显著提高融合蛋白活性的短肽。目前蛋白领域研究中常用的连接肽主要有(Gly4Ser)3，而本发明所采用的连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS，使得CFP-lO-ESAT-6-EspC融合蛋白中各自蛋白的空间构象及活性得到更好的实现，与混合肽、或其他融合蛋白相比，本发明融合蛋白的特异性及诱导效果具有明显的进步。本发明提供的融合蛋白对结核病致病及免疫预防机制的研究有重要意义，从而对结核病的控制具有积极的意义。
【附图说明】
[0019]图1为ELISA检测各组中PBMC在融合蛋白CFP-lO-ESAT-6-EspC作用下分泌细胞因子IL-2的情况；
图2为ELISP0T检测不同处理组中PBMC分泌IFN-γ的水平；
图3为ELISP0T检测不同处理组中PBMC分泌TNF-α的水平；
图4为ELISP0T检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平；其中本发明融合蛋白的连接肽为GGGGSGGGSGGSGS ； (Gly4Ser) 3-融合蛋白组的连接肽为(Gly4Ser) 3，其他序列均与本发明融合蛋白相冋；
图5为ELISP0T检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平；实验组孔中含有本发明融合蛋白，阳性对照组中含有植物凝集素PHA ;
图6为ELISP0T检测不同处理组中PBMC分泌IFN- γ的水平。
【具体实施方式】
[0020]一种融合蛋白，包含CFP-10、ESAT_6和EspC三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。
[0021]优选的，连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。
[0022]更优选的，连接肽的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
[0023]优选的，CFP-10、ESAT_6和EspC蛋白为全序列蛋白或表达抗原活性的部分功能区域多肽。
[0024]优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC、CFP-10-连接肽-EspC-连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-CFPlO-连接肽-EspC、ESAT6-连接肽-EspC-连接肽-CFP10、EspC-连接肽-CFP-10-连接肽-ESAT-6或者EspC-连接肽-ESAT-6-连接肽-CFP-10。
[0025]优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC。
[0026]优选的，融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0027]优选的，编码融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-EspC的核酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0028]上述任一项所述的融合蛋白能够诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白。
[0029]上述任一项所述的融合蛋白作为结核病检测抗原的应用。
[0030]上述任一项所述的融合蛋白在结核病预防治疗中作为刺激物的应用。
[0031]上述任一项所述的融合蛋白作为刺激物，应用于结核病致病及免疫预防机制的研究，以及进一步的对结核病的控制中。
[0032]以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0033]实施例1:CFP-10-ESAT-6-EspC融合蛋白目的基因合成及原核表达载体的构建编码 CFP-10、ESAT-6 和 EspC 蛋白的基因分别为因 ID: 886194，esat~6^
因ID: 862098，e印?基因ID: 885770。利用其全序列或者表达抗原活性的部分功能区域序列，设计引物。
[0034]I)分别用CFP10、ESAT-6和EspC的上下游引物，用PCR分别扩增CFP_10、ESAT_6和EspC的目的片段，使用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增并回收上述片段。
[0035]2)采用人工合成方式合成两种带有连接肽核苷酸序列的核苷酸链，其中一种核苷酸链(下文简称连接肽链I)两端分别包含CFP-10和ESAT-6部分序列，中间为连接肽的碱基序列(SEQ ID NO:4)，另一种核苷酸链(下文简称连接肽链2)两端分别包含ESAT-6和EspC部分序列，中间也为连接肽的碱基序列(SEQ ID NO:4)
3)取CFPlO DNA模板、连接肽链I的DNA模板各I μ 1，用CFPlO的上游引物和连接肽链I的下游引物进行重叠PCR，获取CFP-10