寡聚精氨酸共价修饰的壳聚糖、制备方法、筛选及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学材料领域，涉及一种聚合物材料，具体涉及一系列寡聚精氨 酸共价修饰的壳聚糖衍生物，其制备方法、筛选及用途。
【背景技术】
[0002] 基因治疗（Gene化erapy)作为一种新兴的治疗手段，已经成为当今医药学领域的 研究前沿。其中，核酸治疗为给包括癌症在内的许多疑难杂症提供了一种崭新的治疗方法。 但是安全高效核酸递送载体的缺乏始终是限制其应用的瓶颈问题，目前，核酸递送载体主 要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率高，但在应用中存在免疫反应、细 胞病理改变、致崎、致突变等安全性问题。基于W上原因，非病毒载体成为较理想的核酸递 送载体。
[0003] 非病毒载体是使用化学材料对核酸分子进行保护并将其递送至祀细胞发挥治疗 作用，可分为天然高分子材料和合成高分子材料。壳聚糖（化itosan，C巧作为一种天然高 分子多糖，2位氨基带有正电荷，能够与带负电的分子相互作用，并且容易进行化学反应对 其结构进行改性，是目前研究较广泛的核酸非病毒递送载体。作为一种优良的高分子材料， 壳聚糖具有生物粘附性、可生物降解、安全无毒等优点。
[0004] 2006年最早报道了应用壳聚糖递送siRNA,(参见Ka1:asH,Alpar册,Development andcharacterizationofnanoparticlesforsiRNAdelivery[J],JControl Release, 2006, 115 (2) : 216-225.)但是较低的转染效率限制了壳聚糖在SiRNA递送 领域的应用。为了提高转染效率，研究了壳聚糖分子量和脱己醜度对纳米粒理化性 质和体外基因沉默效率的影响（参见LiuX,HowardKA,DongM,Hieinfluenceof polymericpropertiesonchitosan/siRNAnanoparticlesformulationandgene silencing[J]，Biomaterials，2007, 28 (6) : 1280-1288);加载siRNA制备纳米粒的方法对 纳米粒理化性质的影响，（参见MaoS,SunW,KisseiT,Qiitosan-basedformulations fordeliveryofDNAandsiRNA[J],AdvDrugDelivRev, 2010,62(1):12-27);在 此基础上，还通过对CS分子进行了各种化学修饰；用咪哇己酸对CS进行修饰（化osn B,Singh,A,Roy,K,EfficientsiRNAdeliverybysecondaryandtertiaryaminemodi円ed polysaccharides[J]，NSTI-Nanotech2008a, 2, 338 - 341);用甘露糖修饰CS(参见石艳，张 慧斌，宗莉.祀向甘露糖受体的载体甘露糖化壳聚糖的全合成及其细胞毒性评价。药物生 物技术，2009, 16(3) :207-211);用转铁蛋白修饰壳聚糖（Mao册，RoyK，Troung-LeVLet 曰1.Chitossn-DNAn曰nop曰rticles曰sgenec曰rriers:synthesis,ch曰r曰cteriz曰tion曰nd transfectionefficien巧.J.JControlRelease, 2001, 70 (3): 399)，精氨酸分子中含带正 电的脈基基团，能够与荷负电荷的分子DNA、SiRNA等静电结合，从而有效透过细胞膜，已有 研究证实精氨酸的数目对寡聚精氨酸的入胞效率有影响（参见化takiS，SuzukiT，化ashi W,etal.Arginine-richpeptides.Anabundantsourceofmembrane-permeable peptideshavingpotential曰scarriersforintracellularproteindelivery[J]. JBiol化em，2001，276(8) :5836-5840)。本发明利用壳聚糖和寡聚精氨酸的特点，合成一 系列寡聚精氨酸-壳聚糖衍生物，并对其体内外递送SiRNA的性能进行评价。专利号为 CN1519035A公开了名称为"壳聚糖-精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法"的专利，将壳 聚糖-精氨酸缀合物作为血液相容性材料，用于提高壳聚糖的抗凝血性能；中国专利号为 CN101780281A公开了名称为"N-精氨酸壳聚糖作为透皮吸收促进剂的应用"的专利，用于 促进大分子及难溶性药物的透皮吸收。本发明经专利查询及文献检索，目前尚未发现探讨 2-7寡聚精氨酸对壳聚糖核酸递送效率影响的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是通过筛选过程提供一种寡聚精氨酸修饰的壳聚糖衍 生物作为非病毒核酸递送载体，该载体细胞毒性低，转染效率高，体内外应用效果好。
[0006] 本发明另一方面还提供了送种寡聚精氨酸修饰的壳聚糖衍生物的制备方法。
[0007] 本发明另一方面还提供了送种寡聚精氨酸修饰的壳聚糖衍生物作为核酸载体的 应用。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0009] 在本发明的一个方面，提供了一系列寡聚精氨酸修饰的壳聚糖非病毒递送载体， 其分子式如下：
[0011] 原料的脱己醜度表示为；游离氨基数目/(游离氨基数目+未脱去己醜基的重复单 元数目）即（y+m)/(x+y+m)，脱己醜度范围为60%-95%。m为化取代游离氨基生成产物 的重复单元数目。
[0012] n表示精氨酸的数目，n= 2-7,即寡聚精氨酸是二聚精氨酸巧2)、H聚精氨酸巧3)、 四聚精氨酸巧4)、五聚精氨酸（?)、六聚精氨酸OO、走聚精氨酸巧7)。
[0013] 优选的是五聚精氨酸（?)、六聚精氨酸OO、走聚精氨酸巧7);
[0014] 最优选的是六聚精氨酸OO。
[0015] 本发明的另一方面，提供了送种聚精氨酸修饰的壳聚糖的制备方法，包括如下步 骤：
[0016] (1)将寡聚精氨酸溶于己酸/己酸钢缓冲溶液中，室温揽拌溶解，得到寡聚精氨酸 溶液；加入邸C/N服作为偶联剂室温揽拌，活化駿基；
[0017] (2)将壳聚糖加入上述（1)溶液中，避光反应；
[0018] (3)将所得混合溶液转移至透析袋，去离子水透析，冷冻干燥后制得寡聚精氨酸修 饰的壳聚糖。
[0019] 聚合物合成路线如附图1所示。
[0020] 其中步骤（1)中
[0021] 优选的己酸/己酸钢缓冲溶液的抑范围是；pH4. 0-6. 0,优选是抑5. 0-6. 0,最优 选是抑5. 5;
[002引优选的邸C的用量，和化的摩尔比例是邸C;化=1~2:1，优选是1. 3~1. 7:1 ; 最优选是1. 5:1;
[002引优选的N服的用量，和化的摩尔比例是畑S;化=1~2:1，优选是1. 3~1. 7:1 ; 最优选是1. 5:1 ;
[0024]优选的反应温度是是10-4(TC;优选是20-3(TC;最优选是24-26°C;
[00巧]优选的反应时间是1. 5-化；优选是3-化；最优选是4h。
[002引其中步骤似中
[0027]壳聚糖的分子量范围；SOOODa~SOkDa;优选是IOkDa-20kDa;最优选是IlkDa-ISkDa；
[002引壳聚糖的用量，和化的比例是壳聚糖：化=4. 5~5. 5:1，优选是4. 3~5. 2:1 ; 最优选是5:1 ;
[0029] 优选的反应温度是是10-4(TC;优选是20-3(TC;最优选是24-26°C;
[0030] 优选的反应时间是10-3化；优选是15-24h;最优选是19-2比。
[0031] 在寡聚精氨酸修饰壳聚糖的制备方法中，最优选的壳聚糖与缓冲液溶剂的比例为 每55mg壳聚糖溶解于IOml溶剂中；
[00扣]其中步骤（3)中
[0033] 透析袋截留分子量范围：3000化~5kDa，优选的范围是3500-12000化
[0034] 优选的透析液；5%己醇水溶液、水、DMSO
[0035] 透析的时间；24-72h
[0036] 产物中优选的壳聚糖中游离氨基（y)与寡聚精氨酸（m)的摩尔比为10:1-15:1。 寡聚精氨酸分子取代壳聚糖游离氨基的取代度水平即m/(x+y+m)~10%。
[0037]反应产物的取代度经电NMR测试计算：取代度为9-20%，优选是10-17%;最优选 11-15%
[0038] 本发明的再一个方面，提供了上述聚精氨酸修饰的壳聚糖作为体内、体外核酸递 送载体的应用。本发明提供了上述系列寡聚精氨酸修饰的壳聚糖作为非病毒递送载体的筛 选过程，获得低毒高效的递送载体，并将其应用于体内、体外核酸递送。所制备得到的壳聚 糖衍生物均能不同程度地增加细胞摄取量，提高转染效率。
[0039] 室温条件下，本发明提供的CS-g-化与核酸分子能够按照一定质量比复合形成纳 米粒。在一个实施例中，上述CS-g-化与SiRNA形成纳米粒递送SiRNA时，寡聚精氨酸的长 度（即精氨酸的数目）对于SiRNA转染效率有显著影响，优选的是寡精氨酸的长度为6时， 即六聚精氨酸对祀基因沉默效率最高。本发明提供的载功能SiRNA纳米粒在体外对肿瘤细 胞有显著的杀伤作用，说明载体可W将SiRNA递送入胞，纳米粒可W通过局部瘤内注射等 方法给药抑制肿瘤生长；CS-g-化递送质粒DNA时，能够观察到质粒DNA较强的表达，说明 该载体也能够有效的将质粒递送入胞。
[0040] 有益技术效果
[0041] 采用一步合成法将寡聚精氨酸共价结合于壳聚糖分子游离氨基上，制备方法简 单；CS-g-Rn与核酸分子形成纳米粒并转染细胞，核酸分子的细胞摄取效率显著提高；筛选 出来的载体CS-g-Re加载SiRNA^UE制备得到的纳米粒对祀基因表达的沉默效率与市售转染 试剂Lipofectamin2000相当；CS-g-Re加载功能性SiRNA应用于体内，抗肿瘤效果良好。
【附图说明】
[0042]图1是实施例1的合成路线。
[004引图2是实施例1中所制备的一系列CS-g-Re载体的细胞毒性柱状图。
[0044] 图3是试验例2中所制备的CS-g-R。与SiRNA形成纳米粒的透射电子显微镜图。 a:载质粒DNA纳米粒的GFP表达；b:Lipofectamine2000转染的GFP表达。
[0045] 图4是试验例3中所制备的载质粒DNA纳米粒转染细胞后DNA的表达情况。
[004引图5是试验例2中所制备的CS-g-R。与SiRNA^UE制备得到纳米粒，不同载体形成的 纳米粒下调祀基因表达的效果。