对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及农产品安全领域，尤其设及一种对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄 曲霉生防菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素主要由黄曲霉（AspergillusfIavus)和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)的代谢产物组成，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中， 毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素BI,其毒性为氯化钟的10倍、祇霜的68倍，被列入严管 的特剧毒物质。农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的重要污 染物。
[0003] 据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25%的农作物产品受真菌毒素的污染， 其中主要就是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素污染已对农产品输出国的对外贸易已产生了严重影 响。黄曲霉毒素主要污染花生、玉米等作物，严重影响我国花生、玉米等作物及其制品的出 口，给我国的出口贸易带来了巨大损失。因此，黄曲霉毒素的有效防治与控制，对于保障我 国食品安全和提升我国农产品出口竞争力具有重要意义。
[0004] 利用不产黄曲霉毒素菌株来抑制产毒菌菌群数量及产毒量的生物防治是目前控 制农产品黄曲霉毒素非常有效的手段。美国近来在黄曲霉毒素生物防治研究方面已取得重 大进展，已经批准两个不产毒素的黄曲霉生防菌株（AF36和NRRL21882)，该黄曲霉生防菌 株在大田大面积使用，取得了显著的经济和社会效益。利用不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株 NRRL21882能有效防治花生黄曲霉毒素污染，其防效可达90%W上，使花生中黄曲霉毒素 的含量能有效控制在限量标准范围内。我国在黄曲霉毒素生防防治方面还处于初步阶段， 暂无登记的防治黄曲霉的生防菌剂。筛选、开发利用防治黄曲霉毒素的生物农药，对解决我 国农产品黄曲霉毒素污染问题将具有重要的应用价值。 阳0化]在农业生产中，使用不产毒素的黄曲霉生防菌株来抑制毒素面临一个重要的不利 因素，即农用杀菌剂。农田系统中，为了防治其他真菌病害，杀菌剂的使用是不可避免的。常 见的不产毒素的黄曲霉生防菌株对杀菌剂敏感，杀菌剂的使用将会抑制运些生防菌种群在 农田系统中的增殖，从而影响生防效果及防效稳定性。
[0006] 因此，筛选抗常用杀菌剂的不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株将能提高生防效果 的稳定性，对防治黄曲霉毒素有着重要应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用。 该黄曲霉生防菌株不仅能有效抑制玉米和花生中黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉 毒素的污染；还对常用杀菌剂多菌灵、戊挫醇和阿米西达具有较高抗性，能够有效降低农田 系统中杀菌剂对其种群增殖的抑制作用，从而维持生防菌的生防效果。 阳OO引本发明提供了一种黄曲霉生防菌株，命名为黄曲霉（Aspergillusflavus)AF054， 保藏编号为CGMCCNO. 9860,保藏日期为2014年11月20日。
[0009] 所述黄曲霉（Aspergillusflavus)AF054对常用的杀菌剂多菌灵、戊挫醇和阿米 西达均具有较高的抗性。
[0010] 具体地，AF054在含10yg/mL多菌灵或25yg/mL戊挫醇或100yg/mL阿米西达 的PDA平板上生长速率与不加药的对照无显著差异。
[0011] 所述黄曲霉生防菌株的生物学特征为：菌落呈黄绿色，产生分生抱子；分生抱子 梗的长度为700ym~1200Jim，直径为11Jim~16Jim，顶囊近球形；分生抱子为球形或近 球形，直径为3. 5Jim~4. 5Jim，抱子表面粗糖。 阳01引 本发明黄曲霉菌株AF054缺乏黄曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、 pksA、aflR、aflj、adhA、estA、norA、adhA和vbs。
[0013] 本发明还提供了所述黄曲霉生防菌株在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长中的应 用。
[0014] 具体地，所述黄曲霉生长在农产品中。
[0015] 所述的农产品为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药或水果。优选地， 所述的农产品为玉米或花生。
[0016] 本发明还提供了一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的生防菌剂，所述菌剂 的活性成分为所述的黄曲霉生防菌株。
[0017] 作为优选，所述的生防菌剂中，所述黄曲霉生防菌株的的抱子数为2~5X105个/ ITlLO
[0018] 所述的生防菌剂的制备方法，包括：W小麦为基质，将小麦浸泡、高溫灭菌后，接 种黄曲霉菌株，在28°C溫度、0. 04-0. 06Mpa气压下发酵48小时。发酵终止后，将溫度升至 40°C，揽拌烘干的发酵产品。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0020] (1)本发明分离获得的黄曲霉不产黄曲霉毒素，能有效抑制农产品中的黄曲霉毒 素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染，提高农产品质量；
[0021] (2)本发明获得的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054具有对常用杀菌剂多菌 灵、戊挫醇和阿米西达的抗性，克服了现有生防菌剂对农田系统中杀菌剂的敏感性问题，有 效提高了生防菌株在田间的适生性和定殖能力，从而提高了生防菌的生防效果。
【附图说明】 阳02引图1为本发明黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失示意图。 阳02引图2为本发明黄曲霉菌株AF054对多菌灵、戊挫醇和阿米西达的抗性示意图。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[00巧]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 黄曲霉毒素Bl购于Sigma公司。
[0027] 实施例1不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054的分离、鉴定 阳02引 1、从±壤、玉米、花生等生境中分离黄曲霉菌株
[0029] 从江苏、浙江、山东、福建、安徽等地的玉米、花生田块中采集±壤，将该±壤用YES 培养基培养分离黄曲霉菌株。每升YES培养基成分：酵母提取物Ig,薦糖lOg，化Cl60g，琼 脂20g，灭菌后加入CuS04.ZnS04l血，0.4%氯硝胺5ml，链霉素100yg/mL。
[0030] 2、用生物测定、薄层层析W及酶联免疫法分析菌株产生黄曲霉毒素的情况。 阳0川具体如下；
[0032] 生物测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3 %环状糊精的YES培养基上， 30°C培养7天后，将菌落用25%氨水熏蒸3分钟，如果菌落背面呈粉红色，该菌株为产毒菌 株；如果菌落背面不变色，该菌株可能是不产毒素菌株，需进行下一步的薄层层析检测。薄 层层析测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0. 3%环状糊精的YES培养基上，3(TC培 养7天后，收集100毫克菌丝和抱子，置于1. 5毫升的离屯、管中，并向其中加入200微升的 80%甲醇；室溫下震荡30分钟后10,OOOg离屯、5分钟，取50微升上清液点到硅胶层析板上， 吹干后将薄层层析板置于展布槽内用无水乙酸预展12厘米，取出凉干后在经过丙酬：=氯 甲烧（8:9。展开10~12cm，然后，取出层析板，365nm紫外灯下观测，有淡蓝色银光斑点的 菌株为产毒菌株；如果没有淡蓝色银光斑点，说明该菌株很可能是不产毒菌株，运些菌株可 进行下一步分子生物学检测。
[0033] 酶联免疫法检测菌株是否产生黄曲霉毒素：按照中华人民共和国国家标准GB/ T5009. 22-2003《食品中黄曲霉毒素Bl的测定》方法，并利用北京市营养源研究所研发的 ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素Bl。
[0034] 通过上述方法分析，筛选出不产黄曲霉毒素的菌株AF054,分离自浙江省绍兴市的 上壤。
[0035] 3、菌株的分子鉴定
[0036] 通过巧调基因序列对真菌AF054进行分子鉴定（Ro化igues P, Santos C,VenaneioA, LimaN.，2011. Species identification of Aspergillus section Flavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALDI-TOF ICMS, and molecular approaches.JAppl Microbiol. 111(4):877-92.)黄曲霉基因组巧调基因cmdA 的PCR扩增所用的引物为化I和化2A，序列为：
[0037] CLl :5> -GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3> 阳的8] CL2A:5' -TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3'。
[0039]PCR反应的体系为：1yLDNA模板（约 4ng)，0.ImM引物各 1yL，IOmMdNTP 0. 5yL25mMMgC122yL，10Xbuffer2. 5yL，聚合酶 1.抓个单位，双蒸水补足至 25yL。 W40] 反应条件为：95 °C预变性3min，94°C变性40s，各组引物53 °C退火40s，72 °C延伸 Imin，进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0041] PCR产物经纯化后送至华大基因进行测序。测序结果在BLAST researches上比对 测序结果化ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。 阳0创菌株AF054的巧调蛋白基因的PCR扩增产物的测序结果分别如SEQIDNO. 1所 示。序列在NCBI上对比结果显示，菌株AF054与黄曲霉菌标准菌株NRRL3357的同源性为 100%。
[0043]菌株AF054在YES培养基上菌落生长较快，30°C条件下5天可长满直径9cm的培 养皿；菌落黄绿色，产生大量分生抱子；分生抱子梗长度一般为700Jim~1200Jim，直径为 11Jim~16Jim，顶囊近球形；分生抱子球形或近球形，直径3. 5Jim~4. 5Jim，抱子表面粗 糖。符合黄曲霉菌株的特征。
[0044] 综上，通过上述各方法从±壤、花生上，分离、筛选和鉴定出不产黄曲霉毒素的黄 曲霉菌株AF054,并对菌株进行了保藏。
[0045] 菌株保藏说明：
[0046] 菌株名称：黄曲霉；拉下名：AspergillusfIavus;菌株编号：AF054 ;
[0047] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、；
[0048]保藏号：CGMCCNO. 9860。 W例保藏机构简称：CGMCC;
[0050] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年11月20日；
[0051] 实施例2不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失鉴定 阳0巧 （1)引物合成 阳053] 为明确不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失情况， 试验参考 了文献F*erng-KuangQiang(Qiang,P.K. ,Horn,B.W.andDorner,J.W. (2005)Sequencebre曰kpointsinthe曰fl曰toxinbiosynthesisgenecluster曰ndfl曰nking regionsinnonafIatoxigenicAspergillusflavusisolates.FungalGenetBio 42, 914 - 923.)中设计的关于毒素合成基因的鉴定引物，对菌株AF054中相关基因进行了 缺失情况鉴定。
[0054]似基因缺失鉴定 阳化5] W提取的黄曲霉菌株AF054的DNA为模板，分别用W上引物进行常规PCR反应，每 个反应均有产毒黄曲霉菌株DNA对照和