合成海藻糖的专用菌株及其用于合成海藻糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品生物技术领域，具体设及一株用于合成海藻糖的解脂亚罗威酵母 菌株（Yarrowialipoidica)CGMCCNO. 11367,及其用于合成海藻糖的方法。
【背景技术】
[000引海藻糖（Trehalose)由两分子a-葡萄糖通过a-1，1糖巧键连接，属于非还原 性二糖（non-re化Cingdisaccharide)，最早在十九世纪早期从黑麦麦角中发现的，后来 在各种动植物，微生物细胞中均发现海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脱水的细胞中 含量丰富。比如，在干燥的复活草（如鱗片卷柏Selaginella16口1(10地如1曰)、休眠的线 虫（nematodes)、脱水面包酵母化aker'Syeast)、干燥的地衣植物中含量丰富巧化ein etal.Newinsightsontrehalose：amultifunctionalmolecule.Glycobiology，13 : 17-27)，运些生物细胞中失去99 %的水分仍能生存若干年，而当有水存在时能迅速恢复细 胞活力。在脱水面包酵母中，海藻糖的含量占据细胞干重的10~15%左右。
[0003] 海藻糖在细胞中的存在，除了作为能源储存外，更多的作为抵御外界不良环境的 保护剂（protectant),使得细胞中的大分子（如酶）在极端条件下（如高溫、低抑、干燥、 冷冻等）仍然具有活性，能维持细胞质中大分子的结构W及维持细胞膜的完整性（化tani andUsui. 1994.Productionoftrehalosebyfermentationanditsapplication.Food Chem，2 :91-95;SingerandNas-Lindquist. 1998.Multipleeffectsoftrehaloseon proteinfoldinginvitroandinvivo.MolCell,I:639-648)0 由于没有还原基团， 海藻糖与富含氨基酸的食品配料混合后在高溫下不会发生美拉德反应，能良好的保持食品 的风味。海藻糖还具有良好的持水性，能与失水细胞中残余的水牢固结合保护生物大分子 的结构完整性度eltonandGil. 1994.IRandRamanspectroscopiesSadiesofthe interactionoftrehalosewithheneggwhitelysozyme.Biopolymers，34 :957-961)。
[0004] 由于海藻糖具有上述优良的生理生化特性，其在医药领域、食品领域W及化妆品 领域都得到十分广泛的应用。
[0005] 在医药领域常用于疫苗、血液制品、抗体的稳定剂，使疫苗在常溫下W及冷 冻的条件下同样具有稳定性，增加血液制品W及抗体在冷冻条件下的稳定性（Patent W01996/022107)。海藻糖还可W和透明质酸配伍用于制备眼部用药传递系统W及润滑剂 (中国发明专利200410036422. 0, 200410075549. 3)，还可W制成关节腔内注射药剂，起到 抗氧化和抗自由基的作用，改善炎症症状，为软骨修复提供所需要的糖分，加速软骨的修复 (中国发明专利200610103472. 5)。同时海藻糖还可W进行衍生化合成其它的药物，在防止 肿瘤的侵袭W及转移具有显著的效果（中国发明专利201010246792. 2,201110150999. 4)。 海藻糖的衍生物还可W用于制备皮肤外用剂，具有促进血液循环，保湿，吸收紫外线W及抗 氧化的功效（PatentW02004/071472,JP2004/001401)。
[0006] 海藻糖由于具有低甜度、非还原性、抗干燥等作用，在食品领域有着广阔的应用前 景。海藻糖的甜度相当于薦糖的45%，口感柔和，能在小肠内被消化吸收，可作营养源。此 外还具有抗腐蚀性，不生成引起離齿的不溶性葡聚糖，不被口腔病原菌所利用，因此可W作 为新型甜味剂，添加于奶粉、口香糖、巧克力、冰洪淋、糖果等食品中。由于海藻糖对酸、热都 非常稳定，不具有还原性，在食品加工过程中不会产生美拉德反应，因此在食品加工过程中 添加一定量德海藻糖，对于淀粉类食品可抑制淀粉的老化，延长食品的保质期；可抑制蛋白 质的变性；对于肉类、油炸类等含脂肪多的食品。添加海藻糖可有效的抑制脂肪酸化，保持 食品原有风味。
[0007] 海藻糖由于具有优良的保湿性使其成为化妆品原料之一。用于皮肤化妆品如洗面 奶中，可抑制皮肤干燥；用于唇膏、口腔清凉剂、口腔芳香剂中，可作为甜味剂、呈味改良剂 及品质改良剂。无水海藻糖可用于护肤霜等中，作为憐脂及酶的脱水剂。
[0008]由于海藻糖在医药、食品、化妆品领域均具有十分重要的功效，而且新的功效正在 不断的被开发应用，因此，如何更加经济的规模化制备就具有十分重要的价值。
[0009] 最开始的海藻糖制备方法是从酿酒酵母细胞中提取得到（己西发明专利 Patent9303490,，日本发明专利JP7000190,JP7099988)。由于提取得率低，需要破 细胞壁，步骤多，难W实际规模化制备。后来发现有些微生物能够W淀粉或麦芽糊精 为原料合成海藻糖，但合成效率较低化atoetal. 1996.Reactionmechanismofa newglycosyItrehalose-producingenzymeisolatedfromthehyperthermopholic archaeumSulfolobussolfataricusKMLBiosciBiotechnolBiochem，60 :921-924)。经 过研究，W麦芽糊精为原料合成海藻糖是在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶（MTSase)W及低 聚麦芽糖基海藻糖水解酶（MTOase)的协同催化下合成的。后来人们将运两种酶分别克隆 并在大肠杆菌中异源表达，纯化运两种酶后能够W低聚麦芽糖（或麦芽糊精）为底物合成 海藻糖。基于运种双酶协同催化合成海藻糖的原理，国内外许多学者申请了合成海藻糖的 发明专利。
[0010] 中国发明专利CN201310128939. 1(新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖 基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用）描述了一种采用分别表达该双酶体系（MTSase 与MTOase)W液化淀粉为底物协同催化合成海藻糖的方法。另外Seo等人采用将麦芽寡 糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行融合，在大肠杆菌中进行表达，再转 化液化淀粉合成海藻糖的报道（Seoetal. 2008.Biofunctionalrecombinantfusion enzymebetweenmaltooIigosyItrehalosesynthaseandmaltooIigosyItrehalose treh曰Iohydrol曰Seofthermophilicmicroorg曰nismMet曰Ilosph曰er曰h曰konensis.J MicrobiolBiotechnol，18 :1544-1549)。但不管是分别表达还是融合表达，使用的两种酶 (MTSase与MWase)均采用大肠杆菌表达。表达的过程较为复杂，需要使用抗生素（如卡 那霉素或者氨节青霉素等）保持筛选压力，还需要使用诱导剂（如IPTG等），另外还需要 破壁大肠杆菌W释放运两种酶，在破壁的同时大肠杆菌的内毒素等有害物质也释放出来， 同时大肠杆菌是致病微生物，不适合用于食品制备。虽然从大肠杆菌中分别纯化运两种酶， 然后W纯酶进行转化液化淀粉合成海藻糖，也可W进行，但是纯化得到纯酶的成本太高。另 夕F，该双酶体系不能W麦芽糖为底物合成海藻糖，而淀粉液化液里面还有较多的麦芽糖，而 麦芽糖难W与海藻糖分离。因此，采用该方法难W规模化生产海藻糖，或成本很高。
[0011] 还有采用单酶体系转化麦芽糖或者麦芽糖浆合成海藻糖的报道。中国发明专利 (申请号201310112536. 8, 一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法）描述了在大肠杆菌中 表达海藻糖合成酶基因，并用经过表面活性剂渗透处理的全细胞转化麦芽糖合成海藻糖。 该方法步骤与使用的试剂较多，比如需要采用抗生素筛选，使用诱导剂诱导，使用表面活性 剂进行处理细胞，转化率也较低。运些限制条件使得该方法难W规模化采用。中国发明专 利（申请号201310182033. 8, 一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法）描述了一 种采用来自恶臭假单胞菌、热带假丝酵母、玫瑰链霉菌或大肠杆菌的海藻糖合成酶，并将该 酶固定来转化麦芽糖合成海藻糖。该方法同样存在步骤繁多的缺点（培养细胞，破壁，纯化 酶，固定化酶等）。另外，采用麦芽糖为底物转化合成海藻糖，由于麦芽糖与海藻糖均属于二 糖，反应液中存在较多的未反应完的麦芽糖（一般仍有20%W上的麦芽糖残留），存在难W 将二者分离或者分离困难。
[0012]因此，研究开发一种能够将淀粉高效转化为海藻糖的新的合成途径对于提高生产 效率，降低生产成本具有十分重要的应用价值。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于克服现有的酶合成或细胞合成海藻糖的不足之处，提供一种能 合成海藻糖的解脂亚罗威酵母菌株（Yarrowialipol^ica)CGMCCNO. 11367及其用于合 成海藻糖的方法。本发明通过遗传工程将解脂亚罗威酵母进行改良，使得该酵母能够合成 麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MWase)W及海藻糖合成 酶（Trehalosesynthase,化eS)，能高效将淀粉液化液或者麦芽糖合成海藻糖。该酵母菌 株除了具备出发菌株的性能之外（合成赤薛糖醇），还具有出发菌株所没有的功能，即：能 由淀粉液化液或麦芽糖合成海藻糖。因此不但可W直接培养该酵母细胞发酵淀粉液化液或 麦芽糖合成海藻糖，还可W用合成赤薛糖醇后的酵母泥作为细胞催化剂，再转化淀粉液化 液或麦芽糖生成海藻糖。
[0014] 本发明中使用的合成海藻糖的酵母菌株是解脂亚罗威酵母灯arrowia lipolytica)，已经于2015年9月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中屯、（北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究