免疫细胞培养试剂盒、免疫细胞培养方法和应用

文档序号:9466797阅读:721来源:国知局
免疫细胞培养试剂盒、免疫细胞培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域,特别设及一种用于免疫细胞培养的试剂盒,W及 一种免疫细胞培养方法和其应用。
【背景技术】
[0002] 众所周知,恶性肿瘤是目前危害人类健康的第一杀手。WHNSCC(头颈部肿瘤)为 例,据统计,全球每年约有650000新的HNSCC病人出现,有约350000癌症患者死于HNSCC。 目前,手术切除瘤体、放疗、化疗依然是HNSCC的常用方法,但运些疗法并未取得令人满意 的效果。单纯手术切除存在预后不佳、复发率和肿瘤转移率较高等缺陷,而且不适合于晚期 癌症患者。而在根治性切除前或后进行化疗也并未达到改善HNSCC患者预后的效果。化疗 常常伴随着多种副作用,例如肠道功能障碍、骨髓抑制、感染性疾病等,运大大影响了病人 生活质量,且至少50%的局部晚期HNSCC患者在治疗后的2年出现局部或远处转移复发。
[0003] HNSCC患者其外周血中具有很低浓度的CD3+、CD4+、和CD8巧细胞,而且运种情况 在进行治愈性手术后仍可能持续数年时间。据报道,肿瘤复发病人的血液中CD4巧细胞数 最低。将HNSCC细胞用IFN-丫或外源性祀向肿瘤抗原解化,可修复CTL对HNSCC细胞的识 另Ij。可见,通过免疫疗法来增强肿瘤细胞对免疫识别的敏感性,从而达到改善临床病程是很 有可能的。
[0004] 通常将机体内辅助T细胞分为Thl和Th2细胞群,Thl细胞群分泌白细胞介 素(interle址in,IL)-2、干扰素(interferon,IFN)-丫、IFN-a、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF)-e等,可W增强肿瘤杀伤细胞作用,激发迟发型超敏反应,是抗肿 瘤细胞免疫的主要细胞群。化2细胞群分泌IL-4、比-5、IL-6和IL-IO等,主要功能为刺激 B细胞增殖并产生抗体,介导体液免疫,是细胞免疫的抑制者,机体THUTH2平衡失调,设及 肿瘤免疫逃逸。 阳005] CTL(巧totoxic T lymphoc5rte)细胞即细胞毒性T淋己细胞,是一类CD3+CD8巧细 胞,能直接攻击带抗原的祀细胞,在T细胞抗肿瘤免疫、抗病毒感染和移植排斥反应中起重 要作用。在肿瘤细胞免疫过程中,树突细胞DC值emlritic Cell)捕获加工肿瘤细胞抗原和 其分泌的MHC-I类和MHC-II类分子结合,形成肤-MHC分子复合物,并提呈给T细胞,活化 CD4巧细胞和CD8巧细胞,启动MHC-I类限制性CTL淋己细胞反应。
[0006] M肥-I类分子表达减少和缺失是肿瘤逃逸CD4+和CD8巧细胞杀伤的主要原因之 一,然而自然杀伤细胞(naturekillercell,NK)的杀伤活性无M肥限制,通过NK细胞毒 因子、穿孔素和TNF杀伤肿瘤细胞。
[0007] 另外,机体内还存在一群既有NK细胞受体,又有T细胞受体TCR的NKT(na化ral killer T)细胞,对TCR刺激可产生大量IL-4及IFN-丫,同时具有ThO型细胞因子产生能 力,具有极强的化1诱导能力和Th2抑制能力。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性, 因此NKT细胞的杀伤活性同样无MHC限制,通过穿孔素、Fas配体和IFN-丫杀伤肿瘤细胞, 从而与CTL和NK相互协调,优势互补,发挥较大的抗肿瘤细胞免疫功能。
[0008] 细胞因子诱导的杀伤细胞CIK(巧tokine-induced killer cells)和NK细胞培养 是自体外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养后获得的一群W CTL细胞或NK细 胞为主的异质细胞。将CIK或NK细胞回输至患者后,其具有对肿瘤细胞的杀伤活性,且有 利于机体免疫能力的提高。当前,由于免疫细胞治疗在防止肿瘤复发和抑制肿瘤转移等方 面具有积极作用,其被认为是抗肿瘤细胞免疫治疗的首选方案之一。
[0009] 抗肿瘤免疫淋己细胞的数量是影响肿瘤防治效果的关键因素之一,体外研究显 示随着抗肿瘤淋己细胞与肿瘤比例的上升,淋己细胞对肿瘤的杀伤效果线性增加。每次 静脉输入100亿W上的抗肿瘤淋己细胞时,可显著改善患者自体抗肿瘤细胞免疫功能。 Retro化Ctin是一种用于提高转染效率的重组人纤维连接蛋白片段(CH-296),1990年 Laurie等人发现运种蛋白片段还能刺激人T细胞DNA合成,可W与抗CD3抗体0KT3 -起用 于刺激T淋己细胞大量增殖,选择与其它细胞因子配伍的方法,达到既能增加细胞增殖数 量,又能获得抗肿瘤效应细胞理想的比例,对于增进免疫细胞抗肿瘤治疗效果尤为重要。
[0010] 2009年Olioso等人报道应用细胞因子rhIFN-丫、rh比-2和OKT抗体培养CIK细 胞,该细胞群中CD3+CD8CTL约占68%,CD3+CD56+NKT约占30%,CD3-CD56+NK细胞群少于 3%。细胞因子比-15、比-2和比-12等被用于培养NK细胞,NK细胞比例94%左右。但是, 目前的CIK和NK细胞培养等方法,过度强调单一细胞成分,而忽略了其它细胞成分在抗肿 瘤细胞免疫的协同和互补优势。例如现有培养方法获得的CIK细胞中,NK细胞和NKT细胞 比例偏少,而NK细胞培养方法又缺乏肿瘤细胞免疫中的生力军CTL细胞群。尽管运些单一 种类的抗肿瘤免疫淋己细胞培养用于实验研究可获得该种类细胞群抗肿瘤的机制,但是应 用于肿瘤患者的临床治疗常常因为缺乏其它抗肿瘤细胞群的协同作用而效果有限。进一步 大部分单一种类的免疫细胞体外培养获得的抗肿瘤效应淋己细胞数量不足,癌症防治效果 等方面还值得进一步改善。

【发明内容】

[0011] 本发明提供一种抗肿瘤免疫细胞培养试剂盒,同时还提供采用该试剂盒培养免疫 细胞的方法。采用本发明方法培养得到的免疫细胞,细胞数量可达100亿个细胞数左右,除 了CTL细胞群外,还含有较多的NK细胞和NKT细胞群。本发明的培养方法制得的免疫细胞 应用于HNSCC治疗中,可W改善因化疗而造成的免疫抑制,延长病人生存期。
[0012] 本发明为达到其目的,采用的技术方案如下:
[0013] 一种用于免疫细胞培养的试剂盒,包括培养液A,所述培养液A为向无血清淋己细 胞培养液中加入rhIFN- 丫、rh比-2、rhIL-15和人转铁蛋白制得。
[0014] 所述rhIFN- 丫、rh比-2、rh比-15和人转铁蛋白在所述培养液中的终浓度依次分 别为 500-1000U/mL、500-5000U/mL、5-50ng/mL、5-30ug/ml。
[0015] 所述试剂盒还包括包被液,所述包被液为向PBS缓冲液或无血清淋己细胞培养液 中加入0KT3抗体和Retronectin制得。
[0016] 优选的,所述0KT3抗体和Retronectin在包被液中的终浓度均为50-200ng/mL。
[0017] 具体的,无血清淋己细胞培养液采用市面商业化的培养基即可,例如,无血清淋己 细胞培养液可采用KBM561培养基、RPMI1640培养基、切toRola301培养基等。
[0018] 本发明第二方面提供一种免疫细胞培养方法,包括如下步骤:
[0019] I)从离体的肿瘤病人的外周血、淋己结、腹水、胸水或肿瘤组织中分离出单核细 胞;
[0020] 2)将步骤1)中的单核细胞接种于激活培养基中,于包被液包被过的培养容器 中培养3~5天,用于激活诱导培养CD3+和/或CD56+细胞;所述激活培养基为向培养 液A中添加所述肿瘤病人的血浆制得,所述培养液A为向无血清淋己细胞培养液中加入 rhIFN-丫、rha-2、rh比-15和人转铁蛋白制得;所述包被液为向PBS缓冲液或淋己细胞基 础培养基中加入0KT3抗体和Retronectin制得;
[0021] 3)将经步骤2)培养的细胞转移至另一培养容器中用培养液A继续培养,每隔2~ 3天更换1次所述培养液A。细胞的总培养时间为9~25天,之后收集培养获得的细胞群, 将其称之为iCIK细胞(improvingc}ftokine-inducedkillercells,改良的CIK细胞), 可用于病人自体回输的抗肿瘤治疗。
[0022] 优选的,rhIFN-丫、rh比-2、rh比-15和人转铁蛋白在所述培养液A中的浓度依 次分别为 500-1000U/mL、500-5000U/mL、5-50ng/ml、5-30ug/ml。优选的,所述 0KT3 和 Retronectin在包被液中的终浓度均为50-200ng/mL。优选的,所述血浆在激活培养基中的 质量百分比为0.5~10%。
[0023] 具体的,所述无血清淋己细胞培养液为RPMI1640培养基、切toRola301培养基或 KBM561培养基。
[0024] 优选的,包被液在使用前8~24小时配制。
[0025] 优选的,步骤1)为从离体的尚未进行化疗的肿瘤病人的外周血、淋己结、腹水、胸 水或肿瘤组织中分离出单核细胞。
[00%] 所述肿瘤病人可W是头颈部肿瘤病人,但并不局限于此。
[0027] 培养液A中还可添加rhIL-12、rhIL-18和rhIL-21等。
[0028] 采用上文所述的免疫细胞培养方法获得的免疫细胞可在
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