一种nkt细胞培养基和nkt细胞培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养领域，尤其设及一种NKT细胞培养基和NKT细胞培养方法。
【背景技术】
[0002] NKT(na化ralkillerT)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞 受体的特殊T细胞亚群。近年来研究显示，NKT细胞作为一类新的免疫调节细胞在抗肿瘤 免疫，克服移植排斥，W及抑制自身免疫性疾病的发生中发挥着至关重要的作用。NKT细胞 的功能异常与多种临床疾病，如：肿瘤的转移，自身免疫性疾病（糖尿病，系统性红斑狼疮， 多发性硬化等）的发生有关。研究还显示，调控NKT细胞的功能可达到对肿瘤W及多种人 类疾病的治疗效果。
[0003] 如今，很多研究在探讨NKT细胞的体外培养，从而为自身免疫性疾病、移植排斥W 及多种肿瘤的治疗开辟一条新的途径。常见的NKT细胞体外培养方法是在添加相应细胞因 子的培养基中培养外周血单个核细胞（PBMC)，在细胞因子的刺激下诱导PBMC成为NKT细 胞。目前，最常使用的NKT细胞培养基是添加细胞因子的含有10%胎牛血清的RPMI1640培 养基，但采用此种培养基培养NKT细胞时，NKT细胞的扩增倍数较低，且培养获得的NKT细 胞的毒性较差。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NKT细胞培养基和NKT细胞培养方法，本发 明提供的培养基有利于NKT细胞的诱导扩增，提高NKT细胞的毒性。
[0005] 本发明提供了一种NKT细胞培养基，包括白蛋白、维生素C、人参皂巧、香茹多糖、 细胞因子和无血清基础培养基。
[0006] 优选的，所述白蛋白在所述NKT细胞培养基中的含量为5~lOwt%。
[0007] 优选的，所述维生素C在所述MT细胞培养基中的含量为1~10yg/mL。
[0008] 优选的，所述人参皂巧在所述MT细胞培养基中的含量为5~15yg/血。
[0009] 优选的，所述香茹多糖在所述NKT细胞培养基中的含量为5~15yg/mL。
[0010] 优选的，所述细胞因子在所述NKT细胞培养基中的含量为1~lOiig/mL。
[0011] 优选的，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或白细胞介素-15。
[001引本发明提供了一种NKT细胞培养方法，包括W下步骤：
[0013]a)、使用上述技术方案所述的NKT细胞培养基培养外周血单个核细胞，获得NKT细 胞。
[0014] 优选的，所述步骤a)具体包括W下步骤：
[001引 al)、外周血单个核细胞在所述NKT细胞培养基中重悬，得到细胞悬液；
[0016]a2)、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培养，获得NKT细胞。
[0017] 优选的，所述细胞悬液中的外周血单个核细胞密度为0. 5XIO6~5X10 6个/mL。
[0018] 与现有技术相比，本发明提供了一种MT细胞培养基和MT细胞培养方法。本发 明提供的MT细胞培养基包括白蛋白、维生素C、人参皂巧、香茹多糖、细胞因子和无血清基 础培养基。本发明提供的NKT细胞培养基含有白蛋白、维生素C、人参皂巧和香茹多糖，通过 四者的协同作用，能够有效促进NKT细胞的诱导扩增，提高培养获得的NKT细胞的毒性。实 验结果表明，采用本发明提供的培养基进行NKT细胞体外培养时，其NKT细胞扩增量，培养 获得的NKT细胞的CD3+、CD56+双阳性表达量，W及培养获得的NKT细胞对K562细胞的毒 性效果都远远优于传统培养基，说明本发明提供的NKT细胞培养基有利于NKT细胞的诱导 扩增，能够提高培养获得的NKT细胞的毒性效果，进而提高培养获得的NKT细胞的疾病治疗 效果。
[0019] 此外，在本发明提供的优选实施方式中，所提供的NKT细胞培养基不含有血清成 分，避免了血清中不确定成分对细胞培养安全性的影响。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据 提供的附图获得其他的附图。
[0021] 图1是本发明实施例5提供的细胞生长曲线图；
[002引图2是采用实施例2提供的培养基培养得到的NKT细胞对K562细胞的毒性效果； [002引图3是采用实施例3提供的培养基培养得到的NKT细胞对K562细胞的毒性效果； [0024] 图4是采用实施例4提供的培养基培养得到的NKT细胞对K562细胞的毒性效果； [002引图5是采用对比例提供的培养基培养得到的NKT细胞对K562细胞的毒性效果。
【具体实施方式】
[0026] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0027] 本发明提供了一种NKT细胞培养基，包括白蛋白、维生素C、人参皂巧、香茹多糖、 细胞因子和无血清基础培养基。
[002引本发明提供的NKT细胞培养基包括白蛋白、维生素C、人参皂巧、香茹多糖、细胞因 子和无血清基础培养基。其中，所述白蛋白又称清蛋白，其在本发明中的主要作用是为细胞 提供氮源等有效营养成分。在本发明提供的一个实施例中，所述白蛋白为人血白蛋白。在 本发明提供的一个实施例中，所述白蛋白在所述NKT细胞培养基中的含量为5~IOwt%;在 本发明提供的另一个实施例中，所述白蛋白在所述NKT细胞培养基中的含量为7~1Owt%。 本发明对所述白蛋白的来源没有特别限定，采用市售商品即可。
[0029] 在本发明中，所述维生素C的主要作用是作为一种抗氧化剂，保护细胞免受自由 基的伤害。在本发明提供的一个实施例中，所述维生素C在所述NKT细胞培养基中的含量 为2~5yg/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述维生素C在所述NKT细胞培养基中 的含量为2~5yg/mL。本发明对所述维生素C的来源没有特别限定，采用市售商品即可。
[0030] 在本发明中，所述人参皂巧的主要作用是促进MT细胞在培养过程中成熟分 化。在本发明提供的一个实施例中，所述人参皂巧在所述NKT细胞培养基中的含量为5~ 15yg/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述人参皂巧在所述NKT细胞培养基中的含 量为8~12yg/mL。本发明对所述人参皂巧的来源没有特别限定，采用市售商品即可。
[0031] 在本发明中，所述香茹多糖的主要作用是通过与人参皂巧协同作用，从而促进NKT 细胞在培养过程中成熟分化。在本发明提供的一个实施例中，所述香茹多糖在所述NKT细 胞培养基中的含量为5~15yg/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述香茹多糖在所 述NKT细胞培养基中的含量为8~12yg/mL。本发明对所述香茹多糖的来源没有特别限 定，采用市售商品即可。
[0032] 在本发明中，所述细胞因子为可将外周血单个核细胞诱导成为NKT细胞的细胞因 子，所述细胞因子包括但不限于白细胞介素-2和/或白细胞介素-15。在本发明提供的一 个实施例中，所述细胞因子在所述NKT细胞培养基中的含量为1~10yg/mL;在本发明提 供的另一个实施例中，所述细胞因子在所述NKT细胞培养基中的含量为4~6yg/mL。在 本发明提供的一个实施例中，所述白细胞介素-2在所述NKT细胞培养基中的含量为1~ 5yg/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述白细胞介素-2在所述NKT细胞培养基中的 含量为2~3yg/mL。在本发明提供的一个实施例中，所述白细胞介素-15在所述NKT细胞 培养基中的含量为1~5yg/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述白细胞介素-15在 所述NKT细胞培养基中的含量为2~3yg/mL。本发明对所述细胞因子的来源没有特别限 定，采用市售商品即可。
[0033] 在本发明中，所述无血清基础培养基是本发明提供的培养基的基础成分。在本 发明提供的一个实施例中，所选用的无血清基础培养基为RPMI(RoswellParkMemorial Institute)提供的RPMI-1640培养基。本发明对所述无血清培养基的来源没有特别限定， 采用市售商品即可。
[0034] 在本发明中，直接将上述各组分按设计的比例混合均匀，即可得到本发明提供的 NKT细胞培养基。
[0035] 本发明提供的NKT细胞培养基含有白蛋白、维生素C、人参皂巧和香茹多糖，通过 四者的协同作用，能够有效促进NKT细胞的诱导扩增，提高培养获得的NKT细胞的毒性。实 验结果表明，采用本发明提供的培养基进行NKT细胞体外培养时，其NKT细胞扩增量最高可 达5. 83XIO8个，培养获得的NKT细胞的CD3+、CD56+双阳性表达量最高可达43. 6%，培养 获得的NKT细胞对K562细胞的毒性效果40:1最高可达56% ;细胞扩增量、CD3+和CD56+ 双阳性表达量、毒性效果远远优于传统培养基。说明本发明提供的NKT细胞培养基有利于 NKT细胞的诱导扩增，提高培养获得的NKT细胞的毒性效果，进而提高培养获得的NKT细胞 的疾病治疗效果。
[0036] 此外，在本发明提供的优选实施方式中，所提供的NKT细胞培养基不含有血清成 分，避免血清中不确定成分对细胞培养安全性的影响。
[0037] 本发明提供了一种NKT细胞培养方法，包括W下步骤：
[0038]a)、使用上述技术方案所述的NKT细胞培养基培养外周血单个核细胞，获得NKT细 胞。
[0039] 在本发明提供的培养方法中，通过使用所述培养基培养外周血单个核细胞，获得 MT细胞，该过程具体包括W下步骤：
[0040]al)、外周血单个核细胞在所述NKT细胞培养基中重悬，得到细胞悬液；
[0041]a2)、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培养，获得NKT细胞。
[0042] 在本发明提供的上述具体的NKT细胞培养方法中，首先将外周血单个核细胞在所 述培养基中重悬。其中，所述外周血单个核细胞（PBMC)优选按照下述方法获取：
[0043] 首先，外周血与生理盐水混合，得到的混合液加到淋己细胞分离液中。其中，所述 外周血与生理盐水的体积比优选为1~2