一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，尤其涉及神经干细胞技术领域，具体涉及一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途。
【背景技术】
[0002]干细胞为许多神经系统疾病治疗带来希望，如帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、老年性痴呆及脊髓外伤性疾病等。研究表明，使用胚胎干细胞治疗帕金森病、脊髓损伤及糖尿病有一定作用，但胚胎干细胞的致瘤性，异体移植的免疫排斥以及伦理学争议限制其应用，进而研究由人成纤维细胞获得诱导多能干细胞(iPSCs)，并成功建立了治疗相关疾病的细胞模型及动物模型。然而研究发现，iPSCs用于临床治疗还面临很多问题，如致瘤性，定向分化效率低，安全性问题。神经干细胞(NSCs)是指一类具有自我复制更新能力、高度增殖和多种分化潜能的细胞，在研究神经系统发育、分化以及治疗神经系统疾病中具有重要的作用，因此，将体细胞直接重编程为诱导神经干细胞(induced neural stem cellsiNSCs)，而不经过iPSCs阶段，从而减少其致瘤性、提高分化效率，成为现在干细胞研究领域中的研究热点。
[0003]在诱导神经干细胞(iNSCs)的研究中，Kim等使用Dox调控的慢病毒载体系统在小鼠成纤维细胞中转入0ct4，Sox2, Klf4, C-myc基因，在含有LIF的MEF上培养3_6天后继续在神经干细胞培养基中培养8-9天，将会有表达PLZF，PAX6等神经干细胞标志的克隆出现，这种“类似神经干”细胞，可以继续分化出星形胶质细胞，神经元，但是此种干细胞在体外只能扩增3-5代。裴端卿等使用非整合质粒载体oriP/EBNA携带0ct4，Sox2, Sv40LT, Klf4和microRNA302-367电转入人尿液中提取的活细胞，然后在神经干细胞培养基中加入CHIR99021，PD0325901，A83-01, Thiazoviv, DMHl，电转后12天可见神经干细胞克隆出现，且能表Soxl, Sox2, Pax6等神经干细胞标志性基因，诱导的神经干细胞能分化成星形胶质细胞，多巴胺能神经元，谷氨酸能神经元，但是不能自然分化为少突胶质细胞，只有在加用PDGF-AA, NT3等小分子刺激后，才可以分化出少突胶质细胞。张素春等利用仙台病毒携带外源0ct4，Sox2, Klf4, C-myc基因，转染人成纤维细胞后在含有LIF，SB431541，CHIR99021，的神经干细胞培养基中培养13天后有神经干细胞克隆出现，这种诱导的神经干细胞可以分化出神经元，星形细胞，少突胶质细胞。但是，从人体获取成纤维细胞是有创伤的操作，而且成纤维细胞在转染前需在体外培养较长时间。而且，老年患者成纤维细胞不容易转染成功。
[0004]由此可见，现有技术中采用病毒载体或质粒载体诱导小鼠成纤维细胞或尿液中提取的细胞时，细胞来源容易受到污染，如从尿液中获取细胞在操作过程中容易污染，特别是从病房获得尿液，更加容易污染，操作过程并不简单，使得神经干细胞诱导的成功率降低，且病毒转染时可能将外源基因整合到细胞基因组中，导致供体细胞基因突变；此外，诱导得到的神经干细胞体外扩增代数少、且无法自然分化为少突胶质细胞，在移植后无法维持自我更新及多向分化的能力，无法体外快速扩增，体细胞转分化的周期长、转分化效率低，数量上无法满足临床需求，而不适用于脑神经损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病，数量能够满足临床需求。
【发明内容】
[0005]因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中诱导的神经干细胞无法体外快速扩增、体细胞转分化的周期长、转分化效率低的缺陷，从而提供一种可以体外快速扩增、体细胞转分化的周期短、转分化效率高的神经干细胞的诱导方法。
[0006]本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中的缺乏有效治疗脑神经损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病的方法的缺陷，从而提供一种使用所述方法诱导得到的神经干细胞用于治疗神经细胞病变疾病中的用途。
[0007]为此，本发明提供了一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法，具体包括:夕卜周血中单个核细胞的提取、外周血中单个核细胞的扩增、非整合性质粒电转染、神经干细胞培养的步骤，其中非整合性质粒为oriP/ΕΒΝΑ-Ι，携带基因为0CT4，S0X2, NANOG, LIN28, c-MYC, KLF-4 and SV40LT。
[0008]上述诱导方法中优选所述单个核细胞为外周血中使用Ficoll密度梯度离心法所得的中间云雾状的细胞层中所含的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞以及极少量的CD34+造血干细胞。
[0009]上述诱导方法中优选外周血中单个核细胞的提取方法为:静脉采血，使用PBS将血液稀释后，密度梯度离心法收集单个核细胞，将离心得到的中间云雾状细胞转移至离心管，加入PBS离心，吸去上清后将细胞重悬于PBS中离心，反复3-6次离心，去上清后将细胞重悬于PBS中计数；优选离心时温度4°C、时间为10分钟。
[0010]上述诱导方法中优选外周血中单个核细胞的扩增方法为:将离心所得单个核细胞重悬于培养基中，孵育2天后去上清更换培养基；隔天更换培养基至14天为止；优选培养基为单个核细胞培养基，孵育条件为37度，5% C02。
[0011]上述诱导方法中优选非整合性质粒电转染方法为:将扩增后的细胞离心，计数，重悬于人⑶34+细胞转染液中，加入质粒后转移至电转染杯中进行转染，转让后置于含有培养基的12孔板中孵育；优选培养基为单个核细胞培养基，孵育条件为37度，5% C02。
[0012]所述单个核细胞培养基配方是基础培养基:49 % (Iscove’ s modifiedDulbecco? s medium) IMDM，48 % Ham’ s F-12，I % 膜岛素-转铁蛋白-砸Insulin-transferrin-seIenium-X supplement，I % chemicalIy defined lipidconcentrate，I % L-谷氨酰胺，0.05mg ml 1 左旋维生素 C，5mg ml 1 牛血清蛋白 BSA，0.018ulml 1 1-硫代甘油1-th1glycero ;加入的化学小分子为:10ng ml 1重组人干细胞因子，1ng πιΓ1重组人白细胞介素3，2U ml 1促红细胞生成素，40ng ml 1胰岛素样生长因子IIGF-1, I μ M地塞米松，100 μ g ml 1全铁转铁蛋白holo-transferrin)，上述诱导方法中优选神经干细胞培养方法为:电转染后的细胞在单个核细胞培养基中培养2天，然后将其离心，去上清，再将细胞重悬在神经干细胞培养基中，接种在事先层粘蛋白包被过夜的12孔板上，密度为4X 15/孔，每隔2天更换一次培养基，注意观察细胞变化，大概在转染后10天左右，皿中会出现神经干细胞克隆，待干细胞继续扩增，在转染后20-30天左右，等到克隆足够大时，先使用Accutase将神经干细胞消化后，使用移液枪将克隆挑出，转移到已经用多聚赖氨酸包被过夜的96孔板上，进行干细胞扩增。
[0013]所述神经干细胞的培养基配方为1.基础培养基:DMEM/F12:neurobasal(l:l),1XN2, 1XB27, I % GlutaMAX(Life Technologies, Carlsbad, USA), 2.需加入的化学小分子为:10ng/ml重组人白血病抑制因子recombinant human leukemia inhibitoryfactor (LIF, Millpore, Billerica,美国)，3μΜ CHIR99021，2 μ M SB431542 (GeneOperat1n, Michigan,美国)。
[0014]上述所述神经细胞病变疾病为脑神经损伤、脊髓损伤、帕金森病、老年痴呆症、肌萎缩性侧索硬化症、糖尿病、多发性硬化，脑卒中。
[0015]本发明技术方案，具有如下优点:
[0016]1.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，首次将从外周血中提取的细胞诱导成神经干细胞，外周血采集方便、取材方便、创伤小，受到操作条件的影响小而不易受到污染。
[0017]2.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，利用非整合性质粒载体将外周血单个核细胞重编程得到的神经