重组单纯疱疹病毒及它感染和制备它的宿主细胞以及它们的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种重组病毒、制备该重组病毒的宿主细胞，感染有该病毒的宿主细 胞，W及所述重组病毒、制备该重组病毒的宿主细胞W及感染有该病毒的宿主细胞的应用。 具体地说，本发明设及一种重组单纯瘤疹病毒、制备该重组单纯瘤疹病毒的宿主细胞，感染 有该重组单纯瘤疹病毒的宿主细胞，W及所述重组单纯瘤疹病毒、制备该重组单纯瘤疹病 毒的宿主细胞和感染有该重组单纯瘤疹病毒的宿主细胞的应用。
【背景技术】
[0002] 基因治疗是现代生物医药治疗手段的一项革命，而载体技术是基因治疗成功的关 键。I型单纯瘤疹病毒化SV-1)载体拥有广泛的宿主细胞谱，能够感染多种细胞并在细胞 中长时间持续表达携带的外源基因。由于其独特的优势，目前已经发展成最有前景的病毒 载体之一。
[0003] 脑啡肤巧NK)，是一种具有神经递质功能的五肤，由前体脑啡肤（pro-enkphalin) 分裂产生。脑啡肤广泛存在于中枢和外周神经系统，突触前膜分泌的脑啡肤能够作用于突 触后膜相应的脑啡肤受体，激活的受体打开相应的巧离子通道，抑制P物质（经痛疼刺激而 释放的活化痛觉传导通路的一种神经递质）的释放等。由于脑啡肤受体的活化能够抑制痛 觉传导通路的活化，从而起到镇痛的作用。因此，人们研发出了一系列的模仿脑啡肤结构的 镇痛药一一阿片类药物。
[0004] 在临床上，阿片类药物是目前治疗慢性疼痛最有效的药物之一。阿片类药物是模 仿了内源存在的脑啡肤结构，能够与脑啡肤突触后膜上的受体结合，激活巧离子通道，从而 起到镇痛的作用。
[0005] 长期的临床实践表明，阿片类药物虽疗效好，但是有着极为恶劣的毒副作用：（1) 首先是成癒性，临床上发现，由于受到慢性疼痛的折磨需要长期间隔的对病人给药，但是连 续给药一周左右，患者明显表现出对药物的依赖渴求等"吸毒"样反应，停止给药后病人会 出现呕吐，失眠，流泪，焦虑等"戒毒"样症状；（2)整个身体技能的不良反应，由于除了在神 经系统，在肾脏，大肠等细胞也有阿片类受体，运些受体被激活后，引起了消化系统、呼吸系 统的一系列的不良反应，具体可表现为便秘，盗汗，呼吸困难等等。
[0006] 正因为阿片类药物在临床应用上的局限性，基因治疗的发展为慢性疼痛的治疗提 供了新的前景。而HSV作为基因治疗的重要载体，具有较大的优势。在慢性疼痛的治疗中， 也有一些针对服V-I开发的药物，且取得了十分振奋人屯、的实验结果。
[0007] 但目前针对服V-I为载体开发的治疗慢性疼痛的基因药物中，目的基因的表达稳 定性、药物作用效果且药物持续时间还有待进一步提高。
[0008] 神经生长因子（NG巧是一种具有神经元营养和促突触生长双重生物学功能的神 经细胞生长调节因子，其主要功能是促进神经系统的生长发育并维持其正常生理功能，促 进损伤的神经再生和修复。目前NGF在神经内外科、骨科、眼科、耳鼻喉科、儿科和内分泌科 都有着显著的疗效，主要用于周围神经损伤和脊髓损伤、烦脑损伤、中枢神经系统缺血、缺 氧的辅助治疗、早老性痴呆、糖尿病性周围神经病变及化疗药（紫杉醇、长春新碱、顺销）等 引起的末梢神经病变，也可W适用于感觉神经、交感神经及中枢胆碱能神经营养不良及发 育不良等病症。
[0009] 目前市场上销售的神经生长因子均提取自小鼠颂下腺，主要商品为恩经复、苏肤 生和金路捷。鼠NGF有如下缺点：（1)鼠NGF和人NGF蛋白序列有10%的差异，疗效可能有 差异，且具有免疫原性，可能诱发抗体反应；（2)鼠源病毒的交叉污染隐患；(3)生产依赖活 体动物。人神经生长因子由于提取困难或者重组工艺缺陷，一直未有产品上市。
[0010] 因此，开发出一种有效再生和修复损伤神经的药物也势在必行，并且该药物的稳 定性、作用效果和持续时间需要有一定的保障。
【发明内容】
[0011] 本发明的第一个目的是为了克服W上缺陷，提供一种能够稳定表达、作用效果好 且持续时间长地治疗慢性疼痛或神经损伤的重组单纯瘤疹病毒，所述单纯瘤疹病毒载体是 通过使单纯瘤疹病毒缺失了编码感染细胞多肤34. 5 (ICP34. 5)的基因和编码感染细胞多 肤4QCP4)的基因、W及可选择的缺失编码感染细胞多肤27QCP27)的基因得到的，所述目 的基因的插入位点包括插入在所述单纯瘤疹病毒载体的潜伏相关转录子编码区（LAT区）， 并且在LAT区的启动子下游。该重组单纯瘤疹病毒携带的目的基因能够在感染所述重组单 纯瘤疹病毒的细胞中稳定表达，且作用效果好，持续时间长。
[0012] 优选的，所述目的基因为编码脑啡肤或神经生长因子的基因。
[0013] 优选的，所述单纯瘤疹病毒分离自亚洲人种。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种制备病毒的宿主细胞，其中，所述病毒为W上所 述的重组单纯瘤疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肤4的基因W及可选择的表达 编码感染细胞多肤27的基因。
[0015]本发明的第=个目的是提供一种感染有病毒的宿主细胞，其中，所述病毒为如上 所述的重组单纯瘤疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肤4的基因W及可选择的表 达编码感染细胞多肤27的基因。
[0016] 本发明的第四个目的是提供如上所述的重组单纯瘤疹病毒、如上所述的制备病毒 的宿主细胞和/或如上所述的感染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗慢性疼痛、神经损伤 和/或戒毒的药物中的应用。
[0017] 本发明通过缺失所述单纯瘤疹病毒编码感染细胞多肤34. 5的基因和编码感染细 胞多肤4的基因、W及可选择的缺失编码感染细胞多肤27的基因，并在LAT区启动子的下 游插入目的基因，实现了目的基因能够稳定的表达，且作用效果好，治疗持续时间长的目 的。另外，本发明还具有如下的优点：（1)给药特异性，避免了全身给药引发的副作用化及 药物弥散；(2)避免了手术、穿刺等对神经系统的二次机械损伤；(3)避免药物的依赖性W 及相关的副作用等等。另外，在所述单纯瘤疹病毒优选分离自亚洲人种的情况下，所制备的 重组单纯瘤疹病毒更适合亚洲人种的侵染和治疗。
[0018] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
【具体实施方式】
[0019] W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0020] -方面，本发明提供了一种重组单纯瘤疹病毒，所述重组单纯瘤疹病毒包括单纯 瘤疹病毒载体和目的基因，其中，所述单纯瘤疹病毒载体是通过使单纯瘤疹病毒缺失了编 码感染细胞多肤34. 5的基因和编码感染细胞多肤4的基因、W及可选择的缺失编码感染细 胞多肤27的基因得到的，所述目的基因的插入位点包括插入在所述单纯瘤疹病毒载体的 LAT区，并且在所述LAT区的启动子下游。
[0021] 根据本发明，所述编码ICP34. 5的基因、编码ICP27的基因和编码ICP4的基因均 为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相关的数据库查到，例如，可W通过登录 Genebank数据库查询到相关的核巧酸序列，运些均是本领域技术人员具有的常规技术手 段，本发明在此不再寶述。
[0022] 根据本发明，所述单纯瘤疹病毒的LAT区被认为在HSV潜伏的建立、维持和激活过 程中起重要作用。其具体的基因序列也为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相 关的数据库或相关的公开出版物查到，例如，可W通过登录Genebank数据库查询到相关的 核巧酸序列，本发明在此也不再寶述。
[0023] 本发明需要说明的是，术语"单纯瘤疹病毒载体的LAT区"与术语"单纯瘤疹病毒 的LAT区"是等同的。
[0024] 根据本发明，将ICP34. 5基因和ICP4基因W及可选的ICP27基因敲除，同时在单 纯瘤疹病毒载体的LAT区插入所述目的基因可有效实现本发明的目的，即，使目的基因稳 定地表达，实现较好的作用效果W及较长的作用时间，并且本发明的发明人发现，同时删除 编码ICP34. 5的基因和编码ICP4的基因，能够获得更高的病毒载体目的产物的得率。
[00巧]本发明