重组单纯疱疹病毒及它感染和制备它的宿主细胞以及它们的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种重组病毒、制备该重组病毒的宿主细胞，感染有该病毒的宿主细 胞，W及所述重组病毒、制备该重组病毒的宿主细胞W及感染有该病毒的宿主细胞的应用。 具体地说，本发明设及一种重组单纯瘤疹病毒、制备该重组单纯瘤疹病毒的宿主细胞，感染 有该重组单纯瘤疹病毒的宿主细胞，W及所述重组单纯瘤疹病毒、制备该重组单纯瘤疹病 毒的宿主细胞和感染有该重组单纯瘤疹病毒的宿主细胞的应用。
【背景技术】
[0002] -、血友病概述
[0003] 血友病化emo地ilia)是一组性联隐性遗传的出血病。其临床上分为血友病A(凝 血因子W缺陷症）和血友病B(凝血因子IX缺陷症）两型，分别由凝血因子W(FW)和凝 血因子IX(FIX)基因突变所致。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000,血友病B 的发病率约为1/25000 ;所有血友病男性患者中，血友病A约占80%~85%，血友病B约占 15%~20%。女性血友病患者极其罕见。
[0004] 临床上，血友病W关节、肌肉、内脏和深部组织自发性或轻微外伤后出血难止为特 征。出血部位常见于负重的大关节（如膝、肘、踩、腕、骼、肩等）和肌肉软组织（腰方肌、上 肢肌、下肢肌等）、内脏（如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等）、皮肤粘膜（如皮肤渺 血、鼻出血、口腔出血、牙銀出血等）。致命性的出血有烦内出血、神经系统出血、咽喉部出血 和无准备的创伤、手术出血等。
[0005] 根据血友病人出血的严重程度和血浆中的FVIII活性/FIX活性的水平，血友病A 分为重型（< 1%)、中型（1-5%)和轻型巧-40%)，出血的表现型与FVIII的缺陷程度有 关。轻型的仅会在创伤或外科手术中血流不止，但是重型的会在创伤后频繁的或是自发的 过度流血，尤其是关节或肌肉创伤。
[0006] 目前，发达国家血友病患者基本能像正常人一样生活，而在我国，血友病患者仍处 于致残率高、生活质量低、预期寿命短的状况中。
[0007] 二、血友病的治疗
[0008] 血友病的现代化治疗始于二十世纪屯十年代，是随着血浆来源的FVIII浓缩液的 工业技术发展而发展起来的。运类产品的普及使得患者可在家中进行治疗，运彻底改善了 血友病的治疗，使得患者的生活质量和寿命有了显著的提升，然而，在十年后的二十世纪 八十年代，大量的病人却死于血源性感染的HIV，且肝炎病毒可在血浆中传输，运使得寻找 一个安全的血友病的治疗显得尤为重要。后来，纯化（冷沉淀、离子交换、凝胶渗透或单克 隆抗体的免疫亲和色谱法）的实现和病毒灭活（溶剂洗涂、热治疗/己氏消毒）或去除（超 滤）技术提高了血源性八因子浓缩产品的安全性，在过去的25年间，肝炎或HIV病毒的血 源性转移已不在发生。轻型的血友病患者可用孤AVP(1-去氨基-8-右旋-精氨酸加压素） 输入治疗。DNA技术的快速发展，尤其是1984年FVHI基因的克隆，使得重组FVIII成为可 能。在1989年发表了第一份两例使用重组FVIII产品的重症血友病患者的临床疗效。
[0009] A型血友病替代疗法最具挑战性的并发症是凝血因子抗体的抑制剂的出现，近 25-30%的患者在治疗的前50天内受影响，抑制剂会使替代疗法失效，使病人无法达到安 全有效的治疗水平，而且有提高发病率和死亡率的危险。而抑制剂的形成原因多种多样， 如种族、MHC基因型、免疫应答基因的多态性等内因，及FVIII注射天数、首次注射FVIII年 龄、FVIII浓缩产品的治疗方式等外因。必须使用绕道治疗化ypasstherapy),也就是利 用APCC(凝血素复合体浓缩液）或基因重组制造的活化第屯因子巧ecombinantActivated FactorVII)，直接活化下游的凝血因子，促进凝血过程的开展。平时，为了减少抗体产生， 应该避免使用产生抗体的凝血因子。不过，部分病人利用类似"减敏治疗"的作法，在长时 间接触少量会发生抗体的凝血因子之后，不再产生任何抗体。当病人体内的抗体消失后，又 可W利用补充凝血因子来治疗疾患，而不需要绕道治疗。
[0010] 为了降低预防治疗注射的频率，现在实际上更专注于发展长效因子的产品，而实 现运一目的的方法就是基因治疗，目前，已经通过融合载体蛋白（如IgG的Fc区）用基因 工程的方法获得，根据I-II期的研究观察到FVIII产物半衰期延长，运可能使静脉注射量 减少至50-100每年（标准是150-180)，目前人们对基因治疗的研究进展良好，W腺病毒为 载体的基因治疗的潜在适用性在研究中，而在B型血友病中已有一例成功的报道。
[0011] 但W腺病毒为载体的基因治疗被证明产生严重免疫事件的风险很高，目前在血友 病的治疗中W腺相关病毒（AAV)载体为主要开发对象，不同研究团队开发的AAV载体持续 表达时间不一，且AAV载体易被机体清除，使得FW因子表达时间过短。
【发明内容】
[0012] 本发明的第一个目的是为了克服上述缺陷，提供一种重组单纯瘤疹病毒，其中，所 述重组单纯瘤疹病毒包括单纯瘤疹病毒载体和编码八因子的基因，所述单纯瘤疹病毒载体 是通过使单纯瘤疹病毒缺失了编码感染细胞多肤34. 5的基因和编码感染细胞多肤4的基 因、W及可选择的缺失编码感染细胞多肤27的基因得到的，所述编码八因子的基因的插入 位点包括插入在所述单纯瘤疹病毒载体的潜伏相关转录子编码区（LAT区），并且在LAT区 的启动子下游，和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肤的基因处。该重组单纯瘤疹 病毒能够稳定持续的表达编码八因子的基因，作用效果好，且作用时间长，另外，该重组单 纯瘤疹病毒不会整合到宿主细胞基因组上，安全性较高。
[0013] 优选的，所述单纯瘤疹病毒分离自亚洲人种。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种制备病毒的宿主细胞，所述病毒为W上所述的重 组单纯瘤疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肤4的基因W及可选择的表达编码感 染细胞多肤27的基因。
[0015] 本发明的第=个目的是提供一种感染有病毒的宿主细胞，所述病毒为如上所述的 重组单纯瘤疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肤4的基因W及可选择的表达编码 感染细胞多肤27的基因。
[0016] 本发明的第四个目的是提供如上所述的重组单纯瘤疹病毒和/或如上所述的感 染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗和/或缓解血友病的药物中的应用。
[0017] 本发明通过缺失单纯瘤疹病毒编码感染细胞多肤34. 5的基因和编码感染细胞多 肤4的基因、W及可选择的缺失编码感染细胞多肤27的基因得到的，并在LAT区启动子的 下游和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肤的基因处插入编码八因子的基因，实现 了编码八因子的基因能够稳定的表达，且作用效果好，治疗持续时间长的目的，该重组单纯 瘤疹病毒可感染而且不破坏已经处于分化状态的骨骼肌细胞；作用时效较其他病毒载体 长，可避免注射频率较高；并不整合到宿主细胞基因组上，因此更加安全。另外，在所述单纯 瘤疹病毒优选分离自亚洲人种的情况下，所制备的重组单纯瘤疹病毒更适合亚洲人种的侵 染和治疗。
[0018] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
【具体实施方式】
[0019] W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0020] 一方面，本发明提供了一种重组单纯瘤疹病毒，其中，所述重组单纯瘤疹病毒包括 单纯瘤疹病毒载体和编码八因子的基因，所述单纯瘤疹病毒载体是通过使单纯瘤疹病毒缺 失了编码感染细胞多肤34. 5的基因和编码感染细胞多肤4的基因、W及可选择的缺失编码 感染细胞多肤27的基因得到的，所述编码八因子的基因的插入位点包括插入在所述单纯 瘤疹病毒载体的潜伏相关转录子编码区（LAT区），并且在LAT区的启动子下游，和/或至少 一处缺失了所述编码感染细胞多肤的基因处。
[0021] 根据本发明，所述编码ICP34. 5的基因、编码ICP27的基因和编码ICP4的基因均 为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相关的数据库查到，例如，可W通过登录 Genebank数据库查询到相关的核巧酸序列，运些均是本领域技术人员具有的常规技术手 段，本发明在此不再寶述。
[0022] 根据本发明，所述单纯瘤疹病毒的LAT区被认为在HSV潜伏的建立、维持和激活过 程中起重要作用。其具体的基因序列也为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相 关的数据库或相关的公开出版物查到，例如，可W通过登录Genebank数据库查询到相关的 核巧酸序列，本发明在此也不再寶述。
[0023] 本发明需要说明的是，术语"单纯瘤疹病毒载体的LAT区"与术语"单纯瘤疹病毒 的LAT区"是等同的。
[0024] 根据本发明，术语"八因子"也称为"凝血因子VIII"，其具体的氨基酸序列也能够 通过登录相关的数据库或相关的公开出版物查到，本发明在此也不再寶述。
[00巧]根据本发明，将ICP34. 5基因和ICP4基因W及可选的ICP27基因敲除，同时在单 纯瘤疹病毒载体的LAT区和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肤的基因处插入所述 编码八因子的基因能够有效实现本发明的目的，即，使目的基因稳定地表达，实现较好的作 用效果W及较长的作用时间，并且本发明的发明人发现，同时删除编码ICP34. 5的基因和 编码ICP4的基因，能够获得更高的病毒载体目的产物的得率。
[0026] 本发明的发明人发现，优选的，将所述目的基因插入到所述LAT区的启动子下游 核巧酸的119499bp-122025bp处时，所述目的基因的表达效果能够得到进一步提高。其中， 所述核巧酸的位置是W整个病毒的基因组5'端第1位核巧酸为起点为基准的。
[0027] 根据本发明另一种优选的实施方式，所述编码八因子的基因的插入位点为所述单 纯瘤疹病毒载体的LAT区的启动子下游和至少一处缺失了所述编码感染细胞多肤的基因 处。在运样优选的情况下，所制备的重组单纯瘤疹病毒在感染宿主细胞后能够实现更好的 作用效果。根据本发明，当所述编码八因子的基因插入到所述单纯瘤疹病毒载体的LAT区 的启动子下游时，所述编码八因子的基因可W不加启动子，而是直接利用LAT区的LAPl和 LAP2启动子。
[0028] 但为了保证能够有效地对编码八因子的基因进行独立地翻译，本发明的目的基因 还优选包括启动子，起始密码子和终止密码子，在运样优选的情况下，在所述重组单纯瘤疹 病毒感染宿主细胞并进行自身基因的表达时，能够转录出独立的且完整的目的mRNA片段， 从而能够有效且独立地对目的基因进行翻译。
[0029] 所述启动子可W为本领域常规的各种启动子，优选选自CMV启动子、MMLV启动子 和RSV启动子所组成的组中的强启动子。