一种重组人3型腺病毒及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体设及一种重组人3型腺病毒 为载体的新型的肠道病毒71型化umanenterovirusyl,EV71)-柯萨奇病毒A16型 (CoxackievirusAlG,CA16)-重组3型腺病毒化ad3)疫苗候选株及制备方法。
【背景技术】
[0002] 手足口病化and,footandmouthdisease,HFMD)是由人类肠道病毒引起的W 发热和手、足、口腔部位的皮疹或瘤疹性咽峡炎为主要临床特征的一种急性传染病。HFMD主 要在5岁W下儿童中高发，该病主要是由肠道病毒71型化umanenterovirusTI，EV71)和 柯萨奇病毒A16型（Coxackievi;rusA16，CA16)两种病原体引起的。该病近些年在世界各地 均有流行报道，虽然临床上可W使用药物对症治疗，但无法控制本病的流行传播，每年高发 期都会有大范围的传染病例出现。疫苗的使用被认为是控制病毒传播的最佳方法。
[0003] 人3型腺病毒（HAdV3)疫苗也在发展之中，其经肠道免疫一般不引起病症，HAdVS 也可W作为经肠道黏膜免疫的载体使用，其六邻体的高变区可W插入15个氨基酸的外源 片段，运样将具有免疫活性的抗原片段展示的人3型腺病毒粒子的表面，随着病毒的复制， 含有抗原片段的重组子就会不断复制，并且展示到人3型腺病毒粒子的表面的抗原片段具 有一定的空间构象，具有更好的免疫原性。
[0004] 中国公开专利201310043885. 9,公开一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应 用，公开了在重组人3型腺病毒上插入EV71中和表位SP70和SP55,其能够同时预防EV71 感染和HAdv3感染的预防，但是对于预防手足病依然无法做到有效的预防。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种重组人3型 腺病毒，其具有可同时预防EV71和CA16,对预防手足口病有显著的效果。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种重组人3型腺病毒，所述人3型腺病毒六邻体上同时插入有EV71的中和表位SP70 和CA16的中和表位VPl-I，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHK犯邸LEYC, 所述CA16的中和表位VPl-I的氨基酸序列为PKPTS畑SFAWQTAT。
[0007] 其中，所述EV71的中和表位SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVRl区，所述CA16 的中和表位VPl-I的替换区为HAdv3六邻体的HVR2区。
[0008] 其中，所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为HVRl区的NRDNAV,所述 CA16的中和表位VPl-I的替换氨基酸序列为HVR2区的TTEGEE。
[0009] -种人3型腺病毒-EV71-CA16的双价疫苗候选株，所述双价疫苗候选株含有权利 要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒。
[0010] 一种载体，所述载体包含上述的重组人3型腺病毒。
[0011] 一种制备上述重组人3型腺病毒的方法，包括如下步骤： 在重组人3型腺病毒基因组E3区插入EV71的VPl蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体 上同时嵌入了EV71的中和表位SP70和CA16中和表位VP1-1，其中，所述EV71的中和表位 SP70的氨基酸序列为YPTFGEHK犯邸LEYC，所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为 HVRl区的N畑NAV;所述的CA16中和表位VPl-I的氨基酸序列为PKPTS畑SFAWQTAT，所述的 CA16中和表位VPl-I的替换氨基酸为HVR2区的TTEGEE。
[0012] 一种重组人3型腺病毒的应用，所述双价疫苗候选株用于手足口病的预防。
[0013] 本发明所提供的重组腺病毒，允许CA16中和表位个别氨基酸的缺失、替换或添 加。但需要保持中和表位的免疫原性；允许被置换的HVR2区个别氨基酸的缺失、替换或添 加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫活性；本发明中嵌入的CA16表 位不限于VPl-I，也可W是其他的保护性T细胞表位或B细胞表位，但需要保持腺病毒的稳 定性和保证外源表位的免疫原性。
[0014] 本发明的有益效果在于：本发明在六邻体衣壳上展示EV71中和表位的同时展示 CA16的中和表位，该重组腺病毒可W产生抗CA16感染的免疫应答，多次免疫注射能加强免 疫，该重组病毒可W同时预防EV71感染和CA16感染，对于预防手足口病具有显著的效果。
【具体实施方式】
[0015] 为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应 理解，运些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的 具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0016] 本实施例中所述的化dv3-EV71，使用的是化dv3病毒株（全基因Genbank号： DQ099432)的六邻体的HRVl区插入EV71-08-02病毒株（全基因组序列Genbank号： FJ360545)的抗原表位序列，氨基酸序列无突变。
[0017] 本实施例所使用的骨架质粒地RAdSP70AE3GFP是利用中国公开专利，公开号 CN103966263A中的制备方法得到的WHAdv3基因组为模板用重叠PCR方法获得的SP70 (5, -tatcccacattcggagaacacaaacaggagaaagatcttgaatat-3,）的DNA序列替换HAdv3 六邻 体基因的HVRl相应序列的突变六邻体片段，然后利用Clal+BamHI双酶切后连接至地R册S 载体上，获得地RSP70Rm3S穿梭载体，用EcoRI+Sall双酶切穿梭载体，与AvRII+PacI 双酶切的骨架质粒地RAdAE3GFP在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组，得到骨架质粒 地RAdSP70AE3GFP。
[0018] 1:构建重组病毒载体 WHAdv3-EV71载体为模版，重叠PCR扩增含有CA16病毒主要中和抗原表位的六邻体 片段，经过ClaI，BamHI双酶切后与经过ClaI，BamHI酶切后的穿梭质粒PB化OR连接 构建穿梭质粒，命名为PB化OR-EV71-CA16。将构建好的穿梭质粒经过EcoRI，SalI双酶 切与骨架质粒地RAdSP70AE3GFP经过化CI，AvRII在BJ5183内同源重组，得到重组质 粒pAdSP70RlVPl-lR2AE3GFP。所使用的引物见表LCAl化为PCR筛选鉴定用特异引物。
[0019] 表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3-EV71六邻体基因使用的引物
将上述重组得到的质粒pAdSP70RlVPl-lR2AE3GFP经过AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，捶救包装得到重组病毒AdSP70RlVPl-lR2AE3GFP。大量培养并CsCl密度梯 度离屯、纯化重组病毒粒子。经过纯化的病毒粒子达到1X1012VPs/ml，测定0D260/0D280 比值约1. 2-1. 4,内毒素检测<10抓/ml。重组病毒AdSP70RlVPl-lR2AE3GFP在肥P-2细 胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，表明重组病毒基因组保持 稳定，没有基因缺少、重组现象。
[0020] 2 :重组病毒的免疫原性实验 制备抗血清，进行血清中和试验，验证重组病毒载体的免疫原性。将纯化的重组病毒AdSP70RlVPl-lR2AE3GFP肌肉注射免疫小鼠，得到多克隆血清，然后进行微量中和试验， W检测重组病毒产生的抗体是否具有体外中和EV71，CA16病毒的能力。
[0021] 免疫3次后第14天采集的小鼠血清中和反应的实验结果见表2,表2为多次免疫 小鼠血清中和效价，实验结果数据表明多次免疫后抗EV71病毒和抗CA16病毒的免疫应答 均得到加强。
[0022] 表2单次免疫血清中和效价
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可W其它方式实现，在不脱 离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述人3型腺病毒六邻体上同时插入有EV71 的中和表位SP70和CA16的中和表位VP1-1，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为 YPTFGEHKQEKDLEYC,所述CA16的中和表位VPl-I的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。2. 根据权利要求1所述的一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述EV71的中和表位 SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVRl区，所述CA16的中和表位VPl-I的替换区为HAdv3 六邻体的HVR2区。3. 根据权利要求2所述的一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述EV71的中和表位 SP70的替换氨基酸序列为HVRl区的NRDNAV，所述CA16的中和表位VPl-I的替换氨基酸 序列为HVR2区的TTEGEE。4. 一种人3型腺病毒-EV71-CA16的双价疫苗候选株，其特征在于：所述双价疫苗候选 株含有权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒。5. -种载体，其特征在于：所述载体包含权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病 毒。6. -种制备权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒的方法，其特征在于：包括 如下步骤： 在重组人3型腺病毒基因组E3区插入EV71的VPl蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体 上同时嵌入了EV71的中和表位SP70和CA16中和表位VP1-1，其中，所述EV71的中和表位 SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述EV71的中和表位SP70的替换氨基酸序列为 HVRl区的NRDNAV;所述的CA16中和表位VPl-I的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT，所述的 CA16中和表位VPl-I的替换氨基酸为HVR2区的TTEGEE。7. -种权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒的应用，其特征在于：所述双价 疫苗候选株用于手足口病的预防。
【专利摘要】本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种重组人3型腺病毒为载体的新型的肠道病毒71型（human？enterovirus71，EV71）-柯萨奇病毒A16型（CoxackievirusA16，CA16）-重组3型腺病毒(Had3)疫苗候选株及制备方法，所述人3型腺病毒六邻体上同时插入有EV71的中和表位SP70和CA16的中和表位VP1-1，所述EV71的中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述CA16的中和表位VP1-1的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT，其具有可同时预防EV71和CA16，对预防手足口病有显著的效果。
【IPC分类】A61P31/14, C12N15/861, A61K39/125, C12N7/01, A61K39/295, C12R1/93
【公开号】CN105219740
【申请号】CN201510630269
【发明人】蒋再学, 田新贵, 陆小梅, 骆庆明, 马强
【申请人】东莞市第八人民医院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月29日