一种受β-环糊精抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种受0-环糊精抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基 因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 环糊精是淀粉及相关基质经酶解环合后得到的由六个W上葡萄糖经a-1,4-糖 巧键连结而成的环状低聚化合物。根据环中葡萄糖的数量，由6、7和8个葡萄糖单元组成 的环糊精分别称为a-、0-和丫-环糊精。环糊精的立体结构是中空圆筒形，具有外腔亲 水、内腔疏水的特性。由于运种结构，使它具有容纳与其形状和大小适合的疏水性分子或基 团嵌入圆筒内而形成包合物的特性，因此，在食品、医药、化工、农业、纺织等工业领域中有 着广泛的应用。
[0003] 目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在环糊精葡萄糖基转移酶 (切。1〇(1姑付;[]1617(3〇35^1付日]13'6拘36，简称〔61'酶，6〔2.4.1.19)催化作用下，通过环化反 应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精过程中，环糊精 会与CGT酶发生结合，导致CGT酶的环化活力下降，出现由环糊精所引起的产物抑制现象， 造成淀粉转化率相对偏低，环糊精生产成本居高不下，环糊精在工业中的应用受到极大的 限制。
[0004] 本发明中所使用的来源于环状芽抱杆菌度acillus circulans) STBOl的0-CGT 酶，环糊精产物对其环化活力有明显的抑制作用，因此，减弱产物抑制作用，提高环糊精得 率，将有利于环糊精的工业化生产。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种降低0 -环糊对环糊精葡萄糖基转移酶抑制作用 的突变体，即将氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示的野生CGT酶的第600位亮氨酸化eu)突变 为酪氨酸灯yr)、谷氨酸（Glu)或精氨酸（Arg),得到突变体L600Y、L600E或L600R。
[0006] 编码所述野生CGT酶的核巧酸序列如SEQIDN0. 1所示，来源于环状芽抱杆菌 度曰cilluscircul曰ns)STB01。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种获得所述突变体L600Y、L600E、L600R的方法。根 据B.CirculansSTBOl野生CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入L600Y、L600E、L600R 密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码突变体L600Y、 L600E、L600R的基因，并在枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)WB600中进行表达。
[0008] 所述方法包括W下步骤： 阳009] (1)定点突变
[0010] 利用快速PCR技术，W含野生CGT酶基因的表达载体为模板进行定点突变。
[0011] 引入LeuSOOTyr突变的引物： 阳01引正向引物：5' -CGACGACGGCCTATGGGCAAAAT-3' '下划线为突变碱基， 阳01引反向引物：5'-ATTTTGCCCATAGGCCGTCGTCG-3''下划线为突变碱基；
[0014]引入Leu600Glu突变的引物： 阳01引正向引物：5' -CGACGACGGCCGAAGGGCAAAAT-3''下划线为突变碱基，
[0016]反向引物：5'-ATTTTGCCCTTCGGCCGTCGTCG-3^，下划线为突变碱基；
[0017] 引入LeuSOOArg突变的引物： 阳0化]正向引物：5' -CGACGACGGCCCGTGGGCAAAAT-3''下划线为突变碱基，
[0019]反向引物：5' -ATTTTGCCCACGGGCCGTCGTCG-3' ' 下划线为突变碱基；
[0020] PCR反应体系均为：5XPrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)IOyLdNTPs(各 2. 5mM) 4yL，正向引物（IOyM)IyL，反向引物（IOyM)IyL，模板DNAIyL，PrimeSTAR服 DNAPolymerase(2.抓/JiL) 0. 5JiL加入双蒸水 32. 5JiL。
[0021] PCR反应扩增条件均为：98°C预变性 4min;随后 98°C10s，55°C15s，72°CSmin进 行35个循环；最后72°C保溫lOmin。 阳02引将PCR产物经过化nl消化化后，转入大肠杆菌巧scherichia coli)JM109感受 态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培 养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B. SUbtiliS WB600感受态 细胞中。各培养基中均添加5 y g/mL硫酸卡那霉素和10 y g/mL赤霉素。
[0023] (2)突变体的表达与纯化
[0024] 挑取含突变质粒的表达宿主B.SUbtiliSWB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、 200r/min下培养8~12h，W4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发 酵4她。将发酵液于4°C、10000巧m离屯、20min W除去菌体，收集上清液采用疏水化en^HP 柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体L600Y、L600E、L600W。各培 养基中添加5 Ji g/mL卡那霉素和10 Ji g/mL赤霉素。 阳0巧]本发明的有益效果：构建了 3个有意义的突变体1^600￥、1^6006^6001?，均实现了降 低0 -环糊精对CGT酶的抑制作用，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。相比野生 CGT酶，突变体L600Y、L600E、L600R与麦芽糊精反应24h后，环糊精得率分别提高了 7. 2%、 7. 4%W及4. 8%。在应用玉米淀粉为底物进行环糊精生产时，L600Y、L600E和L600R能够 有效提局P-环糊精得率。
【具体实施方式】 阳0%] 实施例1突变位点的确定
[0027]CGT酶在环化反应过程中的底物结合模型为：第一步直链淀粉结合到麦芽糖基结 合位点1 (MBSl)，然后通过麦芽糖基结合位点2 (MBS2)，并在其帮助下直链淀粉链通过底物 结合凹槽定位在亚位点上，淀粉链切断后，在亚位点附近氨基酸残基的帮助下完成环化，生 成的环糊精与酶蛋白迅速分开。然而，在酶催化反应的过程中，环糊精可在MBSUMBS2和活 性中屯、处与酶W氨键或疏水相互作用相结合，从而造成产物抑制。
[0028] 通过来源于B.circulansstrain251的环糊精葡萄糖基转移酶的PDB晶体结构 (PDB编码1D3C)分析可知，具有线性混合型抑制的CGT酶，环糊精在麦芽糖基结合位点2处 有多处氨基酸结合位点，其中，环糊精与酶在Leu600处W疏水相互作用相结合，并阻碍了 底物通过凹槽传递到活性中屯、。该氨基酸位点可能与CGT酶的产物抑制有关。将其突变为 不同类型的氨基酸可能会影响其产物抑制情况。
[0029] 实施例2突变体L600Y、L600E和L600R的制备
[0030] (1)定点突变
[0031] 利用快速PCR技术，W含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突 变。
[0032] 引入LeuSOOTyr突变的引物：
[0033]正向引物：5'-CGACGACGGCCTATGGGCAAAAT-3'' 下划线为突变碱基，
[0034]反向引物：5'-ATTTTGCCCATAGGCCGTCGTCG-3'' 下划线为突变碱基；
[0035] 引入Leu600Glu突变的引物：
[0036]正向引物：5,-CGACGACGGCCGAAGGGCAAAAT-3'，下划线为突变碱基，
[0037]反向引物：5'-ATTTTGCCCTTCGGCCGTCGTCG-3^，下划线为突变碱基；
[0038] 引入LeuSOOArg突变的引物：
[0039]正向引物：5'-CGACGACGGCCCGTGGGCAAAAT-3'' 下划线为突变碱基，
[0040]反向引物：5'-ATTTTGCCCACGGGCCGTCGTCG-3'' 下划线为突变碱基；
[0041]PCR反应体系均为：5 XPrimeSTAR Buffer (Mg2^Plus) IOyLdNTPs(各 2.5mM)4yL，正向引物（IOyM)IyL,反向引物（IOyM)IyL,模板DNA IyL,PrimeSTAR服 DNA Polymerase(2.抓/JiL) 0.5 JiL加入双蒸水 32.5 JiL。 阳0创 PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98°C预变性4min;随后98°C10s， 55°C15s，72°C8min进行 35 个循环；最后 72°C保溫lO