脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊及制备培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微囊化细胞培养技术领域，具体设及一种脱乙酷几下质/簇甲基纤维 素干细胞微囊及制备培养方法。
【背景技术】
[0002] 微胶囊本身是一种把分散的固体物质、液滴或气体包封在一层致密膜中形成的包 覆体复合结构，用于包覆的致密膜通常是由天然或合成高分子材料制成。由于其具有上述 包覆的微囊按结构，其功能应用中可W将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围 在珠状的微囊里，而小分子的物质、培养基的营养物质可W自由出入半透膜，达到便于催化 或培养的目的，所W微囊经常被用于细胞=维培养，即微囊化细胞培养。
[0003] 微囊化细胞培养中采用微囊的亲水性半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不 会溢出，同时小分子物质及营养物质可W自由出入半透膜；囊内用作为细胞的培养环境，与 液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故相比其他的微珠载体、支架等常规的=维培养方式 细胞生长好、密度高。
[0004] 目前微囊化细胞培养中，包膜材料最通常采用的是海藻酸钢/聚赖氨酸微胶囊； 其中，海藻酸钢是属于从海洋的褐藻中提取的直链阴离子多糖，具有良好的生物相容性，并 且其分子结构孔隙和稳定性都比较好，所W其在具有力学骨架长期稳定优势的条件下，非 常适合于被用作微囊的半透膜骨架，既具有良好的生物相容性，又能保持良好的通透性。聚 赖氨酸是人工合成的阳离子聚合物，在水相中与阴离子海藻酸钢混合时，两者的阴、阳离子 发生快速反应交联成厚约20~100ym半透膜的微胶囊。
[0005] 但是，上述海藻酸钢/聚赖氨酸微胶囊在用作为药物缓释、祀向释放控制、或者是 一些活性成分保护中，基本上能较好地满足使用的要求。但是在作为干细胞培养载体使用 时，海藻酸钢与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合，易被培养液成分破坏而导致包膜破 碎，并且还容易引起微囊周纤维化反应。因此微囊内不能形成较好的细胞生长环境，细胞培 养扩增效率较低、形成的凝胶珠硬度较高，不利于干细胞的培养。
【发明内容】
[0006] 本发明实施的目的在于克服现有海藻酸钢/聚赖氨酸微胶囊的缺陷，提供一种脱 乙酷几下质/簇甲基纤维素干细胞微囊及其制备和培养方法。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0008] 一种脱乙酷几下质/簇甲基纤维素干细胞微囊的制备方法，方法步骤包括：
[0009] 获取簇甲基纤维素和脱乙酷几下质；
[0010] 将所述簇甲基纤维素用质量体积分数1~2%的醋酸分散后，加入至化Clz溶液中 进行凝胶化，形成簇甲基纤维素凝胶；
[0011] 将所述脱乙酷几下质用醋酸盐缓冲液分散后，再加入待培养的干细胞，制成脱乙 酷几下质和细胞的混合悬液；
[0012] 将所述混合悬液加入至簇甲基纤维素凝胶中进行凝聚交联，并将凝聚交联后的得 到微囊用巧樣酸钢溶液进行浸泡处理。
[0013] 本发明进一步还提出采用上述方法直接制备得到的脱乙酷几下质/簇甲基纤维 素干细胞微囊。
[0014] 本发明相比海藻酸钢/聚赖氨酸的微囊，W脱乙酷几下质和簇甲基纤维素作为壁 材，通过复凝聚法形成通透性和分散性比较均一的微囊包膜。先通过异种电荷静电吸附结 合，同时脱乙酷几下质的吸附能力也增强了形成包膜的稳定性和强度。并且，运两者分子 结构上都是经过基团修饰的分子聚合物，都具有非常多的氨基、酸键等活性结构，在结合之 后包膜分子内部还能进一步增加更多的氨键及分子间作用力；所W在原有静电结合的基础 上，能够形成更加复杂的分子结构，大大增强了包膜的抗机械、耐热等方面的性能，在浸滞 于培养液中进行细胞培养时，相对能提供更加稳定的细胞生长环境。使最终形成的包膜比 海藻酸钢与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合要强得多；并且两者都是聚合多糖，相互之 间融合性较为优良，不会形成微囊周纤维化反应。
[0015] 同时，本发明还提出用上述微囊进行细胞培养的方法，方法过程包括：将脱乙酷几 下质/簇甲基纤维素干细胞微囊于培养容器中进行大量培养。
[0016] 采用本发明的上述培养方法，细胞具有更好的生长和代谢的环境，微囊包膜具有 良好的溶胀、缩胀等性能，用于细胞培养时其透性和稳定性上更好一些，能形成较好的细胞 生长环境，提升细胞培养扩增的效率。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0018] 本发明实例提出一种脱乙酷几下质/簇甲基纤维素干细胞微囊的制备方法，步骤 包括：
[0019] S10,获取簇甲基纤维素和脱乙酷几下质；
[0020] S20,将簇甲基纤维素用1~2%的醋酸分散，制成簇甲基纤维素溶液，并加入至 化Clz溶液中进行凝胶化，形成簇甲基纤维素凝胶；
[0021] S30,将脱乙酷几下质用醋酸盐缓冲液分散后，再加入待培养的干细胞，制成脱乙 酷几下质和细胞的混合悬液；
[0022] S40,将脱乙酷几下质和细胞的混合悬液加入至簇甲基纤维素凝胶中进行凝聚交 联，并将交联后的得到微球置于巧樣酸钢溶液中进行浸滞处理，即可得到本发明的脱乙酷 几下质/簇甲基纤维素干细胞微囊。
[0023] 本发明相比海藻酸钢/聚赖氨酸的微囊，W脱乙酷几下质和簇甲基纤维素作为壁 材，通过复凝聚法形成通透性和分散性比较均一的微囊包膜。脱乙酷几下质是将几下质进 行脱乙酷基后形成的，是具有大量正电荷基团的的动物纤维素；其结构与植物纤维素非常 相似，都是六碳糖的多聚体，分子量都在100万W上；并且由于它的分子结构中带有不饱和 的阳离子基团，因而对带负电荷的同类物质具有强大的吸附作用；簇甲基纤维素是纤维素 酸化（簇甲基化反应是酸化技术的一种）之后形成的阴离子型纤维素酸，具有较高的取代 度和取代均匀度；由于两者分别带有不同的电性，可W先通过异种电荷静电吸附结合，并且 脱乙酷几下质的吸附能力也增强了形成包膜的稳定性和强度。
[0024] 并且，运两者分子结构上都是经过基团修饰的分子聚合物，都具有非常多的氨基、 酸键等活性结构，在结合之后包膜分子内部还能进一步增加更多的氨键及分子间作用力； 所W原有静电结合的基础上，能够形成更加复杂的分子结构，大大增强了包膜的抗机械、耐 热等方面的性能，在浸滞于培养液中进行细胞培养时，相对能提供更加稳定的细胞生长环 境。因此，最终形成的包膜比海藻酸钢与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合要强得多；并 且两者都是聚合多糖，相互之间融合性较为优良，不会形成微囊周纤维化反应。
[00巧]基于本案中优选的实施方式中，上述步骤SlO中获取的物料中，脱乙酷几下质采 用脱乙酷度90%W上的脱乙酷几下质进行，除了在可溶性上比较好之外，更主要地是不饱 和阳性基团密度更大一些，运样相比吸附性更强一些。
[00%] 同时步骤S20中对簇甲基纤维素用Ca2+进行凝胶化的过程中，离子强度除了会影 响凝聚的程度之外，Ca2+本身还有促进簇甲基纤维素和脱乙酷几下质之间交联结合的功能； 如果浓度进一步增大，后续形成的微囊包膜的硬度比较大，缩胀性能和初性不足，会影响微 囊的品质。所W在实施的过程中，按照形成簇甲基纤维素凝胶中质量体积分数1~3%的 化Clz浓度进行，比如要制备IOOmL的簇甲基纤维素凝胶液，可W采用50mL的1~2%的醋 酸分散簇甲基纤维素，另用50mL制备质量体积分数2~6%的化Cl2,然后将运两者混合， 混合之后形成凝胶原液，凝胶原液中化Clz终浓度则为所要求的1~3%质量体积分数。
[0027] 在制备的过程中，步骤S40中的簇甲基纤维素已经是凝胶的形态，所W细胞悬液 的加入不能采用表面滴加的方式进行，而只能采用针头注射的方式进行。通过注射针头将 悬液加入至凝胶内，那么在接触的表面上两者结合之后就会相互结合并固化形成包膜。
[0028] 同时，进一步为了保证形成微囊之后，细胞能具有相对比较适合的生长和扩增的 能力，步骤S30制备的混合悬液中优选细胞与脱乙酷几下质的混合悬液中干细胞的浓度控 制0. 5~2XIO7个/mL。微囊内包覆的细胞密度过低，在培养的过程中比较难W快速生长 增殖；而如果过高，本身微囊内的空间有限，细胞之间的空间和养料竞争加剧，位置处于