一种利用光敏基因创制避荫性玉米种质的方法
【技术领域】
[0001] 在本发明属于植物转基因技术及作物遗传育种领域，具体设及一种利用光敏基因 创制避荫性玉米种质的方法。
【背景技术】
[0002] 随着耕地面积的日益减少，人们对玉米的需求量越来越大，提高玉米的产量是我 国主要的生产目标。要提高玉米产量，选育优良的玉米种质是关键，而转基因育种技术是与 常规育种方法相比更为经济有效的措施之一。
[0003] 在影响玉米产量的多种因子中，光信号尤为重要，光不仅作为一种能源，还作为一 种重要的环境信号。光敏色素在植物个体发育过程中作为主要的光受体，发挥了重要的作 用。在植物中，光敏色素通常为几个同源基因构成一基因家族，在各个物种中都有其独特的 基因家族，功能也有一些特殊的变化。
[0004] 从有关光敏色素研究可W看出光敏色素对作物的产量有着直接的影响。如：Alexan化a等人利用拟南芥/?片疆因转化马铃馨，最终使马铃馨块茎产量增加。 Boccalan化O等人也利用拟南芥巧?术盛因转化马铃馨，转基因植株在田间种植的结果显示 可增加光和效率并且高度密植时避阴性反应很弱。Kong等人将拟南芥/?知基因转入水稻 后，都使水稻产量增加，并改善了水稻的农艺性状。但迄今为止，还尚未见到有关利用光 敏色素基因在玉米株型育种上发挥作用，培育适应合理密植的玉米品种的相关报道。
[0005] 本发明利用光敏色素信号通路对玉米光敏色素性状进行改造，将玉米中光敏色素 基因再转入玉米中，提高玉米避荫性，改良玉米品质及特性，进而提高其产量。另外，本发明 选择的是玉米内源的光敏色素基因进行研究，其原因是因为目前为止，基本都是通过转外 源光敏色素基因来进行修饰作物性状，如将拟南芥的光敏色素转入水稻、小麦、马铃馨、棉 花等等。对于转内源光敏色素基因还未有研究。外源基因转入受体中，可能会造成基因排 斥，使得基因不易转入，即使成功转入也可能会造成基因沉默。而转内源基因大大增加转基 因株系阳性率，减小基因沉默的可能。因此，本发明对玉米种质的发展及改善玉米避荫性有 着均有较大的价值和意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的就是针对玉米避荫性问题，提供一种利用光敏色素基因在玉米 中过表达，引起植物光信号机制的有利变化，从而改良植物的株型和避荫性的新途径。
[0007] 本发明所提供的创制避荫性玉米种质的方法包括将光敏色素基因家族中的 化知厶化知义化_炒7基因分别导入玉米，得到光敏色素基因过量表达的转基因玉米后，进行 田间试验筛选和创制避荫性优良的玉米种质的步骤。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： (1)植基因表达载体的构建： 1)目的基因的获得：从玉米B73中分别扩增得到玉米内源光敏色素基因巧?知厶巧?知义 /?片A送公司测序后将扩增序列正确的目的基因产物保存在4°C冰箱备用； 2) 载体大片段的获得： 植物表达载体大片段（pTFlOl. 1-化i-r-nos): 在pTFlOl. 1基础载体上(其中含有《ar基因作为筛选基因)，添加启动子化 终止子T-NOS后构建的新的表达载体，光敏色素基因（/?知A/?知义/?炒。将插入在 pTFlOl. 1-化体T-DNA区中化W做和況?a/酶切位点间，启动此目的基因表达的是 玉米泛素化启动子化切心。化终止此目的基因表达的是/'-COS终止子； 植物表达载体大片段（pCUbil390): 其T-DNA区中含有潮霉素憐酸转移酶（妊W)选择标记基因和启动潮霉素憐酸转移酶 (妊口7)的仍必口仿启动子，玉米光敏色素基因（化知A化知义化炒。将插入在T-DNA区中 化Mffi和成el酶切位点间，启动目的基因表达的是玉米泛素化启动子化切心。却终止目的 基因表达的是终止子； 3) 准备好上述DNA片段后，再将化知A化知义化_炒7的DNA片段与载体大片段分别经 酶切，于16°C连接过夜，将连接产物经酶切验证后送公司测序；将测序结果正确的连接产 物热激转化农杆菌感受态细胞，用壮观素、利福霉素抗性培养基筛选转化的农杆菌，挑取单 菌落进行菌液PCR鉴定；将验证后的农杆菌菌液保存备用； (2) 通过农杆菌介导的方法转化玉米愈伤组织： 1) 浸染： 将含有构建好的植物表达载体的农杆菌接种到含50mg/L利福平和50mg/L壮观霉 素的Y邸培养基，于28°C培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mLY邸培养基中， 28°C、180r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至 0成。。=0. 5 ;4°C、4000r/min离屯、10min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待 转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含乙酷下香酬（AS)的浸染培养液，黑暗浸染3 mi打； 2) 共培、恢复和筛选： 将已浸染了农杆菌的愈伤组织置于含灭菌纸的培养皿上，吸干多余水分后放空皿培 养，21°C暗培养3d;3d后的愈伤组织接种到恢复培养基上25°C暗培养7d;恢复培养后 的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草下麟的选择培养基上；25d后将抗性愈伤组织转 接到新鲜的筛选培养基上；连续筛选3代，除草剂浓度按1.5mg/L、3mg/L、4. 5mg/L递增； 每次转接都淘汰褐化的愈伤组织； 3) 转基因植株的再生： 选取抗性愈伤组织，转移到分化培养基上，2-3周后，将分化出的幼苗转移到生根壮苗 培养基上，生根壮苗培养基为：MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT0.25 g/L+薦 糖30g/L+琼脂6 g/L pH 6.0;26°C光照培养16小时/d,即得到T。转基因再生植株； 对再生植株进行PCR检测、测序等分子检测，筛选出阳性T。植株自交留种； (3) 按随机区组试验设计高低不同密度种植方案，种植转基因植株W及其与常用自 交系的（3至5个）杂交组合，调查测定相关数据，对田间试验结果进行分析，筛选获得避荫 性W及产量优良的转基因玉米种质。
[0009] 截至目前，本发明已成功获得高代转基因玉米植株，田间实验证明，光敏色素基因 的过量表达，对玉米株型有显著影响。
[0010] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 迄今为止，尚未见到有关利用光敏色素基因在玉米株型育种上发挥作用的相关报道。 玉米光敏色素基因转入玉米，导致过表达，支持了重要农业作物过表达光敏色素具有重要 作用的假设。近年来，生物技术方法尝试减少避荫反应来提高高密度种植作物的产量。一 个有效的策略是通过光敏色素的过表达来抑制伸长反应。由于光敏色素控制植物的生理过 程，过表达光敏色素基因对植物生理过程的调控机制有所影响。
[0011] 此外，本发明选择了玉米内源基因进行研究，目前为止，现有研究基本都是通过转 外源光敏色素基因来进行修饰作物性状，如将拟南芥的光敏色素转入水稻、小麦、马铃馨、 棉花等等。对于转内源光敏色素基因还未有研究。外源基因转入受体中，可能会造成基因排 斥，使得基因不易转入，即使成功转入也可能会造成基因沉默。而转内源基因大大增加转基 因株系阳性率，减小基因沉默的可能。通过转基因技术中的农杆菌介导法转化玉米，改良玉 米品质及特性，培育出具有优良避荫性的玉米转基因植株，并在玉米株型育种上发挥作用， 从根本上解决玉米种植密度受限的问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。
[0012]
【附图说明】
[001引图1为扩增目的基因化知A化知满]电泳图； 图2为扩增目的基因/?炒7的电泳图； 图3为图玉米幼胚诱导出的愈伤组织图； 图4为图玉米愈伤组织的分化图； 图5为图分化出的幼苗转生根培养图； 图6为拔节期转基因株系的对照差异图，左边为转基因18-5993::7皿％知7株系，右边 为转基因18-599R::通?化炒7株系； 图7为抽雄期转基因株系的对照差异图。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 下面结合【具体实施方式】对本发明的上述
【发明内容】
作进一步的详细描述。
[0016] 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上 述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括 在本发明的范围内。
[0017] 实施例1 本实施例为光敏色素基因化知厶化知义/?炒7的克隆： 1.化知A化知满]克隆： 用PrimerPrimier5.0软件设计PCR引物，将合成的全长引物稀释为10ymol浓度， 对反转录产物CDNA利用LATaq酶进行PCR，退火溫度为62 °C。
[0018]AlF:5'TCGGATCCGAATTCATGTCTTCCTTGAGGCC3'， AlR:5'GTCGAGACTAGTTCAATGTCCAGCTGCTGA3' ； A2F:5'TCGGTACCGGATCCGAATTCATGTCTTCCTCGAG3'， A2R:5'GTCGAGACTAGTTCATCGTCCAACTGCTGA3'。
[0019] 扩增体系（20JiL)为：
反应结束后，将PCR产物在1.0 %琼脂糖上检测（图1)，并回收目的条带，送公司测 序，结果正确。
[0020] 2. /?炒7的克隆
在上游引物添加化W"/酶切位点（下划线碱基)，下游引物添加況731酶切位点（下划线 碱基)。酶切位点之前添加3个保护碱基。
[0021] 扩增体系（50JiL)为： SXpsBuffer 10yL dNTRnix 4 yL 上游引物 2 iiL 下游引物 2 iiL DNA模板 5yL 局保真酶 0. 6JiL d地20 26. 4yL 扩增程序为： 94°C，3min;98°C，10s;72°C，90s;：M个循环；72°C，8min;12°C保持 反应结束后，将PCR产物在1.0 %琼脂糖上检测（图2)，并回收目的条带，送公司测 序，结果正确。
[002引 实施例2 本实施例为农杆菌介导法转化玉米过程： 1.农杆菌热击感受态细胞的转化 (1)取-70°C保存的100yL农杆菌感受态细胞(实验室中已保存)，置于冰上解冻至冰 水混合物状态。
[0023] (2)加入1yL构建好的植物表达载体，轻轻摇匀后，放置冰上30min。
[0024] (3)置于液氮中速冻1min, 37°C水浴5min,然后加1血YEB液体培养基(含50 mg/血利福平)，28〇C慢速振荡培养4h。
[00巧](4)将100yL培养物涂于含利福平（50mg/mL)和壮观霉素（50mg/mL)的YEB平板上，正面向上放置30min,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，28°C培养大约48 h。
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