一种貉的荧光pcr检测方法及其扩增引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种动物源性成分的检测方法，特别设及一种骆的巧光PCR检测方法 及其扩增引物和探针。
【背景技术】
[0002] 近年来，肉和肉制品的渗杂渗假事件频频被媒体曝光，已经成为中国食品质量控 制面临的重要挑战之一。不法分子将价格相对廉的猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛肉、羊肉销售。近 日有报道称，不法商贩将皮毛用的狐狸、水貂等肉渗入牛羊肉中进行销售，而运些肉并非是 正规的食用肉来源，加工食用对健康风险很大。而除了狐狸、水貂外，骆作为另一种常规皮 毛用动物，其肉也有被冒充成其他肉类进行销售的风险。动物物种成分检测是打击肉制品 制假渗假的有效手段，但目前并没有一种针对骆成分的高效准确的检测方法。
[0003] 形态学方法是传统的动物种属鉴定方法，然而受其准确性和重复性较差，已不能 满足对肉制品等一系列动物制品渗假现象的监管与控制的需求。种属鉴定的免疫学方法大 都直接鉴定样本中的蛋白成分，其基本原理是抗体抗原反应，但免疫学方法存在对样本材 料要求高，检测准确率低等缺陷，如动物食品若经过加热、騰制等处理，其蛋白结构一旦遭 到破坏，免疫学方法便不再适用。而分子生物学方法，基于核酸等遗传物质的高稳定性和多 样性等特点，已被广泛应用于物种种属鉴定，特别是WPCR技术为基础的核酸检测方法被 应用到物种鉴别已有20年的历史。实时巧光PCR是在PCR反应体系中加入巧光基团，利用 巧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。利用实时巧光 PCR技术，可W对骆进行动物成分定性检测，CN103757117A和CN103757116A的发明公开了 食品和饲料中骆成分快速检测试剂盒的制备和检测方法，但该发明采用的引物和探针的灵 敏度和特异性不理想，导致检测的灵敏度和特异性的不足。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种骆的巧光PCR检测方法，采用了具有很高的特异性和 灵敏度引物和探针，可准确、快速鉴定骆源性成分，可有效的用于肉制品和皮毛等的真伪鉴 另IJ，可协助有关部口有效打击肉及肉制品制假贩假的恶劣行径。 阳0化]本发明还提供了用于上述检测方法的扩增引物和探针，特异性强，灵敏度高。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 一种骆的巧光PCR检测方法，包括如下步骤：
[0008] 一、样本DNA提取：取0. 2g样本，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒进行 DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100yL水中得样本DNA液；
[0009] 二、实时巧光PCR扩增检测：
[0010] 实时巧光PCR反应体系如下：IOiiLPremixExTaq,上游引物0.4化，下游引物 0. 4yL，探针0. 4yL，步骤一得到的样本DNA液1yL，用水补足体积至20yL;应用巧光定 量PCR仪进行反应，反应程序为：（1) 95°C，IOsec;似95°C，5sec;60°C，23sec;40个循环；
[0011] S、结果判定：Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。
[0012] 本发明基于具有高度物种特异性的骆线粒体12S核糖体RNAQ2S ribosomal RNA)序列（GenBank登录号：GU256221. 1)设计了具有物种特异性的引物和探针，实现W Real-time PCR的方法对骆进行物种成分检测。本发明由于其引物和探针具有很高的特异 性和灵敏度，可准确、快速鉴定骆源性成分，可有效的用于肉制品和皮毛等的真伪鉴别，可 协助有关部口有效打击肉及肉制品制假贩假的恶劣行径。相对于现有技术的骆源性成分检 测引物和探针，本发明的引物和探针特异性和灵敏度更高。 阳01引作为优选，所述上游引物的序列为：5' -TCACCCTCCTCAAGTGACAA-3'。 阳014] 作为优选，所述上游引物的浓度为IOpmol/yL。
[0015] 作为优选，所述下游引物的序列为：5' -TCTTCTGGGTGTAAGCCAGA-3'。
[0016] 作为优选，所述下游引物的浓度为IOpmol/iiL。
[0017] 作为优选，所述探针的序列为：5' -CGGAAGGTGTGCTTGGACTA-3'。 阳01引作为优选，所述探针的浓度为IOpmol/ y L。
[0019] 作为优选，所述探针的5'端标记FAM报告巧光基团，3'端标记Eclipse泽灭巧光 基团。 W20]-种用于骆的巧光PCR检测方法的扩增引物，包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的序列为：5' -TCACCCTCCTCAAGTGACAA-3'，所述下游引物的序列为： 5' -TCTTCTGGGTGTAAGCCAGA-3'〇
[OOW-种用于骆的巧光PCR检测方法的探针，所述探针的序列为：5' -CGGAAGGTGTGCTTGGACTA-3'，其5'端标记FAM报告巧光基团，3'端标记Eclipse泽灭巧 光基团。
[0022] 本发明的有益效果是：采用了具有很高的特异性和灵敏度引物和探针，可准确、快 速鉴定骆源性成分，可有效的用于肉制品和皮毛等的真伪鉴别，可协助有关部口有效打击 肉及肉制品制假贩假的恶劣行径。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0024] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。 阳〇2引实施例：
[00%] 1、引物和探针的设计 W27]基于具有高度物种特异性的骆12S核糖体RNA (12S ribosomal RNA)序列(GenBank登录号：GU256221. 1)，用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用Primer Express设计软件，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和巧光探针若干组。将设计得 到的引物和探针--进行BLAST验证化ttp://blast. ncbi. nlm. nih. gov/)，W保证引物的 高特异性。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针，并在探针上标记了巧光信 号，W实现实时巧光检测，引物和探针由生物公司合成。
[0028] 表1骆的巧光Real-time PCR物种成分检测的引物和探针
[0029]
[00川 F:上游引物；R:下游引物；P:探针.
[0032] *引用自GB/T25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA 的质量。
[0033] 2、样本DNA提取
[0034]取0.2g样本，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒（PromegaFF3750)，按照 说明书进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100yL水中得样本DNA液。提取过程设置W水 替代样品的提取空白对照。
[0035] 3、实时巧光PC