金线莲炭疽病lamp检测引物及其可视化检测方法

金线莲炭疽病lamp检测引物及其可视化检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明金线莲炭痘病LAMP检测引物及其可视化检测用法，专用于金线莲炭痘病 高特异性、灵敏度可视化快速检测，同时可用于田间金线莲炭痘病的早期诊断和病菌的监 测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 金线莲是多年生珍稀中草药，又名花叶开唇兰，也有人将其称为金丝草和金线入 骨消等，具有很高的药用价值，如清热凉血、接风利湿、强屯、利尿、固肾、平肝等功效。作为近 年来备受推崇的保健药材，商家对此开发出了不少相关产品，受到消费者的广泛喜爱，但野 生金线莲对生长环境的要求苛刻，加上人工的过度采挖，已面临灭绝的境地，目前，人工栽 培是解决上述问题的最佳方法。金线莲的栽培技术也十分成熟，但金线莲的病害问题也日 益凸显，金线莲种植大棚中出现了金线莲移栽后炭痘病严重发生，炭痘病的病原菌为胶抱 炭痘菌，该病菌分类上属于真菌界，半知菌亚口，腔抱纲，黑盘抱目、黑盘抱科的刺盘抱菌属 及圆盘抱属，胶抱炭痘菌菌丝最适宜生长的溫度为28°c，分生抱子产生及萌发的最适溫度 为28°C至32°C，相对湿度为85%。目前金线莲生产上炭痘病发病面积大，传染速度快，严重 影响到金线莲的产量和品质。同时，由于目前缺乏有效的病害早期诊断技术，发病后盲目大 量使用药剂防治也引起金线莲的农药残留，造成食品安全问题。因此，研发出金线莲病害的 早期快速诊断并进行及时监测，对保障金线莲健康生产及食品安全至关重要。
[0003] 目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统 检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作 过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高， 不适宜在基层部口推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等溫扩增（loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术是一种高效率的核酸等溫扩增方法，该方法短时间 内实现产物的大量扩增，灵敏度比PCR高，且操作步骤简便，无需特殊设备，检测结果可由 肉眼判断，极适合于在基层生产部口推广应用。本研究基于环介导等溫扩增（LAMP)技术， 建立金线莲炭痘病的可视化检测，根据LAMP技术原理，选取金线莲炭痘病菌的核糖体基因 上的内转录间隔区（Internal化anscribedSpacer, 口巧勒1序列的6个区域，进而设计出 4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，W巧黄绿素（Calcein)的巧光显色指 示剂作用，建立可视化LAMP检测技术。该体系对金线莲炭痘病检测具有高的特异性与灵敏 性，检出限为10fg，比常规PCR灵敏度高1000倍。并在此基础上研发出可视化快速检测试 剂盒。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段；无需特殊仪器设备，同 时开发的快速检测试剂盒适合田间金线莲生产中开展实地检测与监测，从而保障金线莲健 康生产及食品安全。
[0004] 目前，对植物病害的传统检测鉴定方法是首先进行病菌分离，通过对已经分离并 纯化的病菌进行培养，观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到植株中，进行致 病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起病害的病原菌的分类和地位。该法作为 最基本的病原菌鉴定方法在一直W来被广泛使用，有着很强实用性，是病原菌的鉴定及病 害检测的方法之一，但是该方法受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经 验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。
[0005] 免疫学检测技术（Immunologicaltechnology)具有操作简单、特异性强，W及检 测时间短的优点，适合开发检测试剂盒。但其不能对检测对象进行扩增，所W灵敏度不及核 酸检测技术高。另外，抗体的制作过程耗时、复杂，提高了检测的成本。运两点缺点限制了 免疫学检测技术的推广使用。
[0006] 聚合酶链式反应（PolymeraseQiainReaction,PCR)是一种利用DNA聚合酶在体 外大量扩增祀序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定、变 异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原菌检测重要的技 术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR(化St-PCR)和实时巧光定量PCR等，主要的缺点是需 要依靠PCR等仪器设备，不利于基层生产上推广应用。
[0007] 环介导等溫扩增化oop-mediatedIsthermalAmplification,LAMP)技术是由日 本科学家开发的一种最新的简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法（Notomietai.， 2000)。LAMP技术是一种新型的核酸恒溫扩增方法。该技术在等溫条件下，可在短时间内使 产物得到大量扩增，在短短的30min~60min内就能实现1〇9-1〇1°倍的扩增同时具有很高的 灵敏度和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断，反应结束后用肉眼观察是否产生焦憐 酸儀沉淀，即可判断祀序列是否存在。亦可在反应液中加入巧光指示剂，使反应结果的肉眼 观察更加的方便、直观和可靠。
[0008] LAMP技术操作简单、快速高效，而且检测特异性非常强，其最大的优势就是在恒 溫条件即可进行扩增反应，无需特殊实验设备，相较于普通PCR技术，其有很多优点(表1 )。
[0009] 表1.LAMP技术与常规PCR技术比较
综上，目前植物病害的检测主要有传统检测和分子生物学检测。其中，传统检测法耗 时、耗力，检测结果可靠性往往比较低；分子生物学检测法主要有常规PCR、化St-PCR和 qPCR等，PCR方法能快速、准确地检测病原，但需特定仪器设备，且检测成本比较高，不适合 基层检验检疫部口的推广应用，使田间病情难W得到及时、准确的检测，严重阻碍了金线莲 产业发展。基于目前金线莲炭痘病在福建省严重发生，因此，建立一套简便、快速、准确、有 效、经济的金线莲炭痘病的检测技术非常重要。此技术可应用于金线莲炭痘病菌引起病害 显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提 供技术支持。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。 目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中 报道极少，金线莲炭痘病的检测国内外均未见报道。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的是针对现有技术中金线莲炭痘病的传统检测方法所需周期长、检测 方法特异性差，PCR检测需要依靠扩增仪等设备，且灵敏度低的问题，提供一种金线莲炭痘 病的LAMP检测引物W及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的金线莲炭痘病的可视 化检测方法。
[0011] 实现本发明的目的包括下列步骤： 1. LAMP引物的设计 根据金线莲炭痘病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS)序列在真菌种间高度变异和种 内稳定性，采用PrimerE邱IorerV4软件设计了对金线莲炭痘病菌具有特异扩增作用的 LAMP检测引物，包括2条外引物（F3和B3)和2条内引物（FIP和BIP)，引物序列分别 为：
2. 金线莲炭痘病快速检测体系的建立 LAMP检测：25yl反应体系中含20mMTris-肥l，10mM(NH4)2S〇4，l〇mMKCl，8mMM拆〇4， 甜菜碱 0. 8 DNA聚合酶为 8U，dNTPs1.0mmol/l，F3 和B3 为 0. 2mmol/l，FIP 和81口各1.6臟〇1/1，巧黄绿素50^111〇1/1，氯化儘500 ^111〇1/1^胖6611-20 0.1%，模板0臟 50~100ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65°C溫育45-60min, 85°C 灭活 5-lOmin。
[0012] 所述的检测方法为巧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述巧光染料目测 观察法：在LAMP反应后，显色结果观察到绿色巧光判断为阳性，澄色判断为阴性。所述琼脂 糖凝胶电泳法：取2y1PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的 梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
[0013] 所述的金线莲炭痘病LAMP检测引物在田间金线莲炭痘病的早期诊断和病菌的监 测和鉴定上的应用。
[0014] 该方法可用于带菌的植株的高灵敏度快速检测。建立金线莲炭痘病快速、简便、特 异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于金线莲炭痘病显症之前的早期监测，确定病害防治 最佳时期具有十分重要的意义。
[0015] 本发明的关键性技术是金线莲炭痘病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方 法。为了验证金线莲炭痘病检测的特异性，本发明W采集分离的25株金线莲炭痘病菌和28 种其它病原真菌为供试材料，对检测的特异性进行LAMP验证。
[0016] LAMP检巧U:25yl反应体系中含 20mMTris-肥l，10mM(NH4)2S〇4，l〇mMKCl，8mM M拆〇4,甜菜碱 0. 8mol/L，化f聚合酶为 8U，dNTPsI. 0mmol/L，F3 和B3 为 0. 2mmol/L， 門口和81口各1.6臟〇1/1，巧黄绿素50^111〇1/1，氯化儘500 ^111〇1/1^胖6611-20 0.1%，模板 DNA50~100ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65°C溫育45-60min, 85°C灭活 5-lOmin。
[0017] 除了 25株金线莲炭痘病菌显色结果可观察到绿色巧光或琼脂糖凝胶电泳检测出 现LAMP特征性的梯形带外，检测了 28种其它真菌菌株的显色结果为澄色或琼脂糖凝胶电 泳没有出现扩增条带。运说明该引物可被用于生产实践中金线莲炭痘病快速可靠的检测和 鉴定。
[0018] 当在用于金线莲组织中存在炭痘病菌的检测时，采用化OH快速裂解法提取金线 莲炭痘病菌的DNA，具体过程如下：（1)将金线莲病叶或病茎洗净、惊干，剪取发病部位；（2) 按Img病叶加入10y1 (0. 5mol/L化0H，0. 5%PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，在12,OOOg 离屯、机中离屯、5min; (3)取上清20Ji1与等体积的0. 1mol/L的Tris-肥1 (P册.0)混合； (4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1y1原液、10倍、100倍、1000倍液作为PCR模 板进行扩增。
[0019] 按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测： ①LAMP反应体系 25y1 :25y1 反应体系中含 20mMTris-肥 1，IOmM(畑4)25〇4,IOmM KCl，8mMM拆〇4,甜菜碱0. 8mo