猴逆转录病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，设及实验动物相关病原的检测方法，具体设 及一种猴逆转录病毒（SRV)的RT-LAMP(ReverseI'ranscriptionandLoop-mediated IsothermalAmplification,反转录环介导等溫扩增反应）检测引物组、检测试剂盒及检测 方法。
【背景技术】
[0002] 猴逆转录病毒（SimiantypeDretrovirus,SRV)，属于逆转录病毒科、肿瘤病毒 亚科的D型病毒。SRV具有逆转录病毒所共有的特性，是单链RNA病毒，内含逆转录酶，病毒 颗粒呈球形，直径80-lOOnm，囊膜上缺乏明显的纤突，感染细胞浆内的病毒为A型颗粒，细 胞外未成熟病毒的核屯、为圆形，成熟病毒的核屯、为圆柱状。病毒W出芽的方式从细胞膜上 释放。SRV可在多种猴的细胞包括猴的B细胞、T细胞、成纤维细胞、唾液腺上皮细胞、膜腺 细胞等中生长。SRV为猴艾滋病的主要病原体之一，.感染后临床上表现为顽固性腹泻、体 重减轻、全身性淋己腺病脾肿大、贫血、中性白细胞减少、淋己细胞减少、坏死性口炎、腹膜 后纤维瘤病等。
[0003] 到目前为止，发现感染SRV病毒并产生猴艾滋病的非人灵长类动物主要是雜猴属 的动物。近年来，已有SRV感染人的报道。SRV必须通过直接接触才能在猴间进行传播， 主要通过猴间相互撕咬使含于唾液中的病毒进入伤口而传播，而在所有的分泌物和排泄物 中，唾液含病毒量最高。SRV也能通过性传播和经胎盘传播。SRV对不同年龄的猴致病性有 差异，3岁W上的猴抵抗力较未成年猴强，6个月至2岁半的猴最易感，6个月W下的猴有母 源抗体的保护。雄猴和雌猴均易感染，但雌猴的病例较多。
[0004] SRV已经被确认为是导致SAIDS的病原体，因此，在猴艾滋病动物模型建立之前一 定要排除运种病原体的干扰。SRV感染的诊断除了检查临床症状，还要结合实验室诊断方 法，常用的实验室诊断方法有PCR法、酶联免疫吸附试验（ELISA)法、间接免疫巧光（IFA) 法、免疫印迹(WB)法、病毒分离法等。PCR法快速、灵敏，但其扩增产物需要进行再一次验 证。病毒分离需要进行细胞培养，周期长、对试验设备要求高，因此，该方法不适合一般的检 。目前，对SRV的检测常用ELISA法和IFA法作为初筛，还必须用WB检测特异性抗体才 能最终确诊。ELISA法和IFA法检测的假阳性率高及WB法操作程序复杂，在一定程度上限 制了其应用范围。因此，不论是为了保障整个猴群的健康还是饲养人员、科研人员的人身安 全，都有必要建立一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法。
[000引本发明所采取的技术方案是： 一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组，其包括一对外引物和一对内 引物，其核巧酸序列分别如下所示： 外引物：
[0009] 一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其包括上述检测引物 组。
[0010] 进一步的，所述猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒中，外引物、内引物的摩尔比 为 1 :8。
[0011] 进一步的，所述猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒中还含有DNA聚合酶、逆转录 酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照、显色液。
[0012] 进一步的，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。
[001引进一步的，所述RT-LAMP反应液含有IOmM dNTP、IOX化ermo化1反应缓冲液、 150mM M拆04水溶液。
[0014] 进一步的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
[0015] 进一步的，所述显色液含有750mM巧黄绿素和5mMMnClz的溶液。
[0016] 一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤： O待检样品RNA的提取； 2) 利用权利要求1的引物组对待检样品进行反转录环介导等溫扩增反应； 3) 结果分析：根据反应液颜色变化判定结果，澄色为阴性，绿色为阳性； 进一步的，步骤2)反转录环介导等溫扩增反应的25 反应体系含有：SRV-F3 0. 2yM，SRV-B3 0. 2yM，SRV-FIP1. 6yM，SRV-BIP1. 6yM，RT-LAMP反应液 12. 5"，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.抓，待检RNA1~10化g，显色液2. 5y1，用DEPC水补齐到25y1 ;然 后于63~65°C反应45~60min。
[0017] 上述检测方法用于非疾病检测或诊断。
[0018] 本发明的有益效果是： 本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果： O高特异性： 本发明根据猴逆转录病毒（SRV) (GenBank登录号为M11841. 1)的主要包膜蛋白基因 (ecK)的部分序列设计了 4条特异性引物，应用上述4条引物，扩增祀序列的6个区域，6个 区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引 物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行； 2) 高灵敏度：最低检测极限可达到Ifg/y1含SRV目标片段的质粒DNA; 3) 快速高效：整个扩增只用45~60min即可完成，扩增产量可达IO9~10 1°个拷贝； 4) 操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行反转录等繁琐步 骤，只需要恒溫水浴锅即可反应，条件比较溫和； 5)结果易读：通过肉眼观察反应管内颜色变化即可判读检测结果，无需电泳等其他任 何分析步骤，适合非专业人:t的现场检测。
【附图说明】
[0019] 图1是实施例3特异性的检测结果图（1:SRVRNA;2:SIVRNA;3:HTLVRNA;4 : DEPC水对照）； 图2是实施例4灵敏度的检测结果图（53￥0臟，1:100口邑/^1质粒0臟61?￥);2:10口邑/ 质粒DNA(SRV) ;3:Ipg/质粒DNA(SRV) ;4:IOOfg/质粒DNA(SRV) ;5:IOfg/ 质粒DNA(SRV) ;6:lfg/yl质粒DNA(SRV) ;7:0.1fg/yl质粒DNA(SRV) ;8:DEPC水对照）。
【具体实施方式】
[0020] W下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0021] 实施例1猴逆转录病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立 猴逆牵专录病毒的RT-LAMP(ReverseTranscription曰ndLoop-mediatedIsotherm曰I Amplification,反转录环介导等溫扩增反应）检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP 反应液、化迅NA聚合酶、逆转录酶、阳性对照和阴性对照、显色液。
[0022] (1)RT-LAMP引物设计：W猴逆转录病毒（SRV)的主要包膜蛋白基因（ecK)为祀基 因，利用软件在线设计SRV特异性R