一种荧光分子探针及其在检测糖类物质中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种荧光分子探针，特别是一种以芘为荧光团的染料分子探针，该荧 光分子探针对水溶性糖，特别是烟草中的水溶性总糖具有较好的检测性能。
【背景技术】
[0002] 烟草中的水溶性总糖包括具有还原性的葡萄糖、果糖、在测定条件下能水解为还 原性单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖）、麦芽糖（水解为2分子葡萄糖）。 烟草燃吸时，水溶性总糖高温裂解成低级的醛、酮和弱酸性（pH5. 3~6. 5)物质，对烟气的 香气和吃味都有正面影响，并能减少烟气的刺激性，因此水溶性总糖是决定烟叶品质的重 要化学成分。
[0003] 最经典的总糖测定方法是费林试剂法以及由此发展出的铜还原滴定-芒森?沃克 法，即通过测定被费林试剂还原的铜的量，查表获得对应的葡萄糖量，计算得出试样的还原 糖（或水溶性总糖）含量。费林试剂比色法是对芒森?沃克法的改进，免去对还原铜的滴 定，直接测定费林试剂生成的酒石酸钾钠铜（590nm)的吸光度，得到还原铜的含量。同样利 用氧化还原反应，3, 5-二硝基水杨酸比色法（DNS)也是目前常用的方法，具有简便快捷易 操作的特点，但稳定性差，易受提取液中其他物质如色素、蛋白质等的干扰。目前烟草行业 标准采用连续流动分析仪测定水溶性糖，其原理是用5%乙酸的水溶液萃取烟草样品，所溶 解的糖类酸水解后在85°C的碱性介质中生成黄色的偶氮化合物，用分光光度计记录410nm 波长的吸光度变化。该方法准确度高、重现性好，缺点在于仪器比较昂贵，且偶氮化反应时 间较长，对羟基苯甲酰肼易在管路中形成沉淀。
[0004] 荧光检测法是最灵敏的检测方法之一，灵敏度比紫外分光光度法高二、三个数量 级，例如海水中铀的检出限可达0.04μg/L;选择性强，不同的物质具有不同的激发和发射 特性，扫描其发射或激发光谱就可较容易地将它们区分开来；此外荧光仪器结构简单、价格 低廉且操作便捷，从实验室检测到工业探伤，以至前沿的生命科学，都大量采用荧光法作为 分析手段。
[0005] 然而许多关注的化学物质不含生色团，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类物 质，无法直接利用荧光进行检测，因此需要设计并合成荧光分子探针，以便将分子识别信息 通过荧光信号有效表达，从而实现直接利用荧光法检测糖类物质。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种荧光分子探针、其制备方法及其在烟草水溶性总糖测定中的应 用。
[0007] 本发明的第一方面提供通式I化合物，
[0008]
[0009] 其中：1-芘丁酰胺基在吡啶环的2位或3或4位取代，-B (0H)2在苯环的间或对位 取代，X为F、Cl、Br或I。
[0010] 在一个优选的实施方案中，本发明通式I化合物具有如下结构式：
[0011]
β-
[0012] 本发明的第二方面提供一种制备通式I化合物的方法，包括以下步骤：
[0013] 1)式1所示的1-芘丁酸与式2所示的氨基吡啶在合适的条件下反应生成是II所 示的中间体；
[0015] 2)式II所示的中间体与式3所示的卤代甲基苯硼酸在合适的条件下反应生成式 I所示的荧光分子探针，
[0016] 其中：Χ的定义通式I化合物中所述。
[0017] 本发明的第三方面提供本发明所述的通式I化合物作为荧光分子探针在检测糖 类物质中的用途。
[0018] 本发明中，所述的糖类物质为水溶性糖类物质（包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖 等），例如烟草中的水溶性总糖。
[0019] 本发明的第四方面提供一种检测糖类物质的方法，该方法采用本发明所述的通式 I化合物作为荧光分子探针，采用荧光法进行检测。
[0020] 在一个优选的实施方案中，本发明所述的检测糖类物质的方法包括以下步骤：
[0021] 1)样品的前处理：用合适的溶剂萃取样品中的糖类物质，然后将萃取溶液在合适 的条件下发生水解反应，然后将水解产物的pH值调节至6. 5-7,得到样品溶液；
[0022] 2)将通式I化合物溶于甲醇中，得到探针母液，再用碱性缓冲溶液稀释至合适的 浓度，得到探针溶液；
[0023] 3)将样品溶液加入到探针溶液中，用荧光光谱仪测定混合溶液荧光强度。根据荧 光强度计算样品中糖类物质的含量。
[0024] 本发明所述的检测糖类物质的方法采用外标法定量，优选的标准物质为葡萄糖。
[0025] 本发明所述的检测糖类物质的方法，其特征在于以下a)至d)项中的一项或多 项：
[0026]a)步骤2)中所述的探针母液的浓度为0· 004~0· 006mol/L(例如0· 005mol/L);
[0027]b)步骤2)中所述的碱性缓冲溶液的pH值为8. 0~11.0 (例如10. 0)，优选的碱 性缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；
[0028]c)步骤2)中所述的探针溶液的浓度为0. 05~1.Ommol/L，优选为0. 07~ 0· 5mmol/L，更优选为 0· 08 ~0· 2mmol/L(例如 0·lmmol/L、0. 15mmol/L)；
[0029]d)步骤3)中，荧光光谱仪的激发波长为310~340nm，混合溶液的发射波长为 450~550nm，优选510nm处的相对荧光强度作为检测信号。
[0030] 在一个优选的实施方案中，本发明所述的检测糖类物质的方法，其中所述的糖 类物质为烟草中的水溶性总糖，其中步骤1)的样品前处理是将样品用酸性溶剂萃取，过 滤，让滤液在合适的条件下发生水解反应，然后用碱性溶液中和水解产物，调节至pH值为 6. 5-7,得到样品溶液；
[0031] 优选地，步骤1)中所述的酸性溶剂为乙酸溶液，优选为4~6v/v%乙酸溶液，例如 5v/v%的乙酸溶液；
[0032] 优选地，步骤1)中所述的水解反应是在滤液中加入等体积的盐酸溶液（优选浓度 为0· 8~1. 2mol/L的盐酸溶液，例如1.Omol/L的盐酸溶液），于90~100°C(优选95°C) 水浴中加热10~20分钟（优选15分钟）；
[0033] 优选地，步骤1)中所述的碱性溶液为NaOH水溶液，优选为浓度为0. 8~1. 2mol/ L的NaOH水溶液，例如1. 0mol/L的NaOH水溶液。
[0034] 在一个具体的实施方案中，本发明提供一种检测烟草中的水溶性总糖的方法，包 括以下步骤：
[0035] 1)的样品前处理是将样品用酸性溶剂萃取，过滤，让滤液在合适的条件下发生水 解反应，然后用碱性溶液中和水解产物，调节至pH值为6. 5-7,得到样品溶液；
[0036] 优选地，步骤1)中所述的酸性溶剂为乙酸溶液，优选为4~6v/v%乙酸溶液，例如 5v/v%的乙酸溶液；
[0037] 优选地，步骤1)中所述的水解反应是在滤液中加入等体积的盐酸溶液（优选浓度 为0· 8~1. 2mol/L的盐酸溶液，例如1. 0mol/L的盐酸溶液），于90~100°C(优选95°C) 水浴中加热10~20分钟（优选15分钟）；
[0038] 优选地，步骤1)中所述的碱性溶液为NaOH水溶液，优选为浓度为0. 8~1. 2mol/ L的NaOH水溶液，例如1. 0mol/L的NaOH水溶液；
[0039]2)将通式I化合物溶于甲醇中，得到探针母液，再用碱性缓冲溶液稀释至合适的 浓度，得到探针溶液；
[0040] 优选地，步骤2)中所述的探针母液的浓度为0. 004~0. 006mol/L(例如 0.005mol/L)；
[0041] 优选地，步骤2)中所述的碱性缓冲溶液的pH值为8. 0~11. 0(例如10. 0)，优选 的碱性缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；
[0042] 优选地，步骤2)中所述的探针溶液的浓度为0. 05~1.Ommol/L，优选为0. 07~ 0· 5mmol/L，更优选为 0· 08 ~0· 2mmol/L(例如 0·lmmol/L、0. 15mmol/L)；
[0043] 3)将样品溶液加入到探针溶液中，用荧光光谱仪测定混合溶液