用于酶抑制的化合物的制作方法
【专利说明】用于酶抑制的化合物
[0001] 本申请是以下申请的分案申请：申请日：2006年11月9日；【申请号】 200680050739. 7 (PCT/US2006/043503);发明名称："用于酶抑制的化合物"。
[0002] 发明背景
[0003] 在真核生物中，蛋白质的降解主要是通过泛蛋白途径介导的，其中需要破坏的靶 蛋白与76个氨基酸的多肽泛蛋白相连接。一旦与靶蛋白连接，泛蛋白化蛋白质就充当26S 蛋白酶体的底物，26S蛋白酶体是一种多催化功能蛋白酶，通过其三种主要的蛋白水解活性 将蛋白质切割成为短肽。尽管蛋白酶体介导的降解在胞内蛋白质更新中具有基本功能，但 是它在I类主要组织相容性复合体（MHC)呈递、细胞凋亡、细胞分裂和NF-κB激活等许多 过程中都具有关键性作用。
[0004] 20S蛋白酶体是一种700kDa圆柱形多催化功能蛋白酶复合体，由28个亚基组成， 这28个亚基构成4个环，其在细胞生长调节、I类主要组织相容性复合体呈递、细胞凋亡、抗 原加工、NF-κB激活以及促炎信号转导中都具有重要作用。在酵母和其它真核生物中，7个 不同的α亚基构成外环，7个不同的β亚基构成内环。亚基作为19S(PA700)和11S(PA28) 调节复合体的结合位点，也是2个β亚基环构成的内部蛋白水解腔的物理屏障。因此，一 般认为蛋白酶体在体内以26S颗粒（"26S蛋白酶体"）存在。体内实验已经证明，抑制20S 形式的蛋白酶体，很容易与抑制26S蛋白酶体联系起来。在颗粒形成期间，切割β亚基氨 基端前序列后，用作催化亲核基团的氨基端苏氨酸残基被暴露出来。因此，蛋白酶体中负 责催化活性的亚基具有氨基端亲核残基，这些亚基属于Ν端亲核（Ntn)水解酶家族（例如， 亲核N端残基为Cys、Ser、Thr和其它亲核部分）。该家族包括例如青霉素G酰基转移酶 (PGA)、青霉素V酰基转移酶（PVA)、谷氨酰胺PRPP酰胺转移酶（GAT)和细菌糖基天冬酰胺 酶。高等脊椎动物除了具有普遍表达的β亚基以外，还具有三种γ-干扰素-诱导性β 亚基（LMP7、LMP2和MECL1)，它们分别替代其正常对应物X、Υ和Ζ，由此改变蛋白酶体的催 化活性。通过利用不同的肽底物，已定义了真核生物20S蛋白酶体的三种主要蛋白水解活 性：胰凝乳蛋白酶样活性（CT-L)，它在大的疏水残基后切割；胰蛋白酶样活性（T-L)，它在 碱性残基后切割；肽基谷氨酰肽水解活性（PGPH)，它在酸性残基后切割。蛋白酶体还有另 外两个次要的特征性活性：BrAAP活性，它在支链氨基酸后切割；SNAAP活性，它在小的中性 氨基酸后切割。蛋白酶体的主要蛋白水解活性似乎是受益于不同的催化位点，因为抑制剂、 β亚基中的点突变以及γ干扰素诱导性β亚基互换使这些活性发生不同程度的变化。
[0005] 近年来，蛋白酶体已成为吸引人的治疗干预癌症、免疫和自免疫疾病、炎症、局部 缺血疾病、神经变性疾病和其他疾病的靶点。到目前为止，FDA批准的唯一蛋白酶体抑制剂 为硼替佐米（VELCADE?)，然而，目前正在对其他几种蛋白酶体抑制剂进行临床评价。到现 在为止，所有这些治疗的蛋白酶体抑制剂目前均通过IV给药。蛋白酶体抑制剂在治疗血液 恶性肿瘤（例如骨髓瘤和淋巴瘤）中的临床应用部分受限于通常需要IV给药，其将通过口 月艮（Ρ0)给药得到改善。然而，由于这些分子的肽本性，Ρ0给药后这些抑制剂的系统暴露取 决于多个因素，这些因素包括胃的ΡΗ、胃肠肽酶、外排栗、胆汁排泄以及肠和肝的代谢活性。
[0006] 用于克服肽被酶降解和增强从消化道至血液的吸收的方法包括制备结构上更不 象肽同时分子量变小的类似物。当所述肽类似物口服给药后获得了令人满意的血液浓度 时，或者在蛋白酶体抑制剂的情况，当蛋白酶体在血液中的活性令人满意地降低时，认为此 类方法取得了成功。
[0007] 上述方法已用于制备肽环氧酮蛋白酶体抑制剂类似物，从而使其可口服。
[0008] 发明概述
[0009]本发明涉及通常称为肽α'，β'-环氧化物和肽α'，β'-氮丙啶的分子。我们 认为母体分子可有效地、不可逆地、选择性地与Ν端亲核（Ntn)水解酶结合，并且可以特异 性地抑制具有多催化活性的酶的某些特殊活性。
[0010] 曾经认为，蛋白酶体仅仅负责破坏变性蛋白和错折叠蛋白，但是现在认为蛋白酶 体是组成型蛋白水解机器，通过信号依赖性方式的降解作用来调节各种胞内蛋白水平。因 此，非常有益的是，鉴定出能够特异性干扰蛋白酶体活性和其它Ntn水解酶活性的试剂，从 而用作探针以研究这些酶在生物过程中的作用。本文描述、合成并研究了靶向Ntn水解酶 的化合物。本文公开了能够有效地、选择性地、不可逆地抑制特定蛋白酶体活性的肽环氧化 物和肽氮丙啶，并且要求保护这些化合物。
[0011]与其它几种基于肽的抑制剂不同，本文描述的肽环氧化物和肽氮丙啶在高达 50μΜ的浓度下不会明显抑制非蛋白酶体的蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋 白酶Β、木瓜蛋白酶和f丐蛋白酶。在更高浓度时，可能会观察到抑制作用，但是如果所述抑 制剂仅仅与底物竞争，将是竞争性的且可逆的抑制。新的肽环氧化物和肽氮丙啶还可抑制 NF-kB激活以及稳定细胞培养物中的p53水平。此外，这些化合物具有抗炎活性。因而，这 些化合物可以是独特的多功能分子探针，用于研究Ntn酶在正常生物过程及病理过程中的 功能。
[0012] -方面，本发明提供含有含杂原子三元环的抑制剂。这些抑制剂在约50μΜ以下 的浓度时，可以抑制Ν端亲核水解酶（例如20S蛋白酶体或26S蛋白酶体）的催化活性。就 20S蛋白酶体而言，特定的水解酶抑制剂在约5μΜ以下的浓度时，抑制20S蛋白酶体的胰凝 乳蛋白酶样活性，而不会抑制20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性或PGPH活性。所述水解酶抑 制剂可以是例如肽α'，β'-环氧酮或α'，β'-氮丙啶酮，所述肽可以是四肽。所述 肽可以包含支链或直链的侧链，例如氢、Q6烷基、Ci6羟基烷基、Ci6烷氧基烷基、芳基、Ci6 芳烷基、Q6烷基酰胺、Ci6烷基胺、Ci6羧酸、Ci6羧基酯、Ci6烷基硫醇或Ci6烷基硫醚，例 如异丁基、1-萘基、苯基甲基和2-苯基乙基。α'，β' -环氧酮或α'，β' -氮丙啶酮的 α 碳可以为手性碳原子，例如（R)或β构型的碳，如本文定义的手性碳原子。
[0013]另一方面，本发明提供药物组合物，其中包含药物可接受载体和药物有效量的水 解酶抑制剂，它改善神经变性疾病（例如阿尔茨海默病）、肌肉萎缩病、癌症、慢性传染病、 发热、肌肉废用、去神经、神经损伤、禁食以及免疫相关性疾病等的影响。
[0014] 另一方面，本发明提供可口服的化合物和药物组合物。
[0015] 另一方面，本发明提供抗炎组合物。
[0016] 另一方面，本发明提供以下的方法：抑制或减轻患者的HIV感染；影响患者的病毒 基因表达水平；改变生物体中蛋白酶体产生的各种抗原肽；测定生物体的细胞、发育或生 理过程或输出量是否由特定Ntn水解酶的蛋白水解活性调节；治疗患者的阿尔茨海默病； 降低细胞的肌肉蛋白降解速率；降低细胞的胞内蛋白降解速率；降低细胞的P53蛋白降解 速率；抑制患者的P53相关性癌生长；抑制细胞的抗原呈递；抑制患者的免疫系统；抑制生 物体的IκΒ-α降解；减少细胞、肌肉、器官或患者中NF-κB含量；影响细胞周期蛋白依 赖性真核细胞周期；治疗患者的增殖性疾病；影响细胞的癌基因蛋白的蛋白酶体依赖性调 节；治疗患者的癌生长；治疗患者的Ρ53相关性细胞凋亡；筛选细胞的Ν端亲核水解酶加工 的蛋白。所有上述方法都包括给予患者、细胞、组织、器官或生物体或使其接触有效量的含 有本文公开水解酶抑制剂的组合物。
[0017] 根据下面的发明详述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将会是显而易见 的。
[0018] 发明详述
[0019] 本发明涉及可用作酶抑制剂的化合物。这些化合物通常可用于抑制在Ν端具有亲 核基团的酶。例如，含有在侧链具有亲核基团的Ν端氨基酸（例如苏氨酸、丝氨酸或半胱氨 酸）的酶或酶亚基的活性，可以被本文描述的酶抑制剂成功地抑制。在Ν端具有非氨基酸 亲核基团（例如保护基或糖基）的酶或酶亚基的活性，也可被本文描述的酶抑制剂成功地 抑制。
[0020] 虽然不希望受任何具体理论的束缚，但是认为Ntn的Ν端亲核基团与本文所述酶 抑制剂的环氧官能团构成共价加合物。例如，在20S蛋白酶体的0 5/Pre2亚基中，一般认 为，N端苏氨酸在与下文描述的肽环氧化物或肽氮丙啶反应后，不可逆地形成吗啉代或哌嗪 基加合物。以上加合物形成过程将涉及环氧化物或氮丙啶的开环裂解。
[0021] 在含有连接至α'碳的这种基团的实施方案中，α碳（构成环氧环或氮丙啶 环部分的碳）的立体化学构型可以是（R)或（S)。本发明在某种程度上基于本文公开的结 构-功能信息，这些信息表明了下述的优选立体化学关系。注意，优选的化合物可能含有多 个立体中心，这些立体中心具有所指出的上-下关系（或者β-α关系，其中图示的β在 纸平面以上）或（R)-(S)关系（即不需要化合物中所有立体中心都符合指出的优选状态）。 在某些优选实施方案中，α'碳的立体化学结构是（R)，即X原子为β或在分子平面以上。
[0022] 关于立体化学结构，遵循测定绝对立体化学结构的Cahn-Ingold-Prelog规则。 例如OrganicChemistry(Fox和Whitesell;JonesandBartlettPublishers，Boston， MA(1994);第5-6节，pl77-178,该节内容通过引用结合到本文中）介绍了这些规则。肽类 可以具有重复的主链结构，侧链从主链单元延伸出来。通常，每个主链单元都有与其连接的 侧链，虽然在某些情况下，侧链是氢原子。在其它实施方案中，并不是所有主链单元都连接 有侧链。可用于肽环氧化物或肽氮丙啶的肽具有两个或以上的主链单元。在某些可用于抑 制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样（CT-L)活性的实施方案中，存在2-4个主链单元，而在某些 可用于CT-L抑制的优选实施方案中，存在3个主链单元。
[0023] 从主链单元延伸的侧链可包括天然脂族或芳族氨基酸侧链，例如氢（甘氨酸）、甲 基（丙氨酸）、异丙基（缬氨酸）、仲丁基（异亮氨酸）、异丁基（亮氨酸）、苯基甲基（苯丙 氨酸）以及构成氨基酸脯氨酸的侧链。侧链还可以是其它支链或直链的脂族或芳族基团， 例如乙基、正丙基、正丁基、叔丁基和芳基取代的衍生基团，例如1-苯基乙基、2-苯基乙基、 (1 _蔡基）甲基、（2_蔡基）甲基、1_(1_蔡基）乙基、1_(2_蔡基）乙基、2_(1_蔡基）乙基、 2-(2-萘基）乙基和类似组合基团。所述芳基可以被以下基团进一步取代：支链或直链C16 烷基、取代的烷基、乙酰基等，或者其它芳基或取代的芳基（例如苯甲酰基等）。杂芳基和杂 环基也可用作侧链取代基。杂芳基包括含氮、氧和硫的芳基，例如噻吩基、苯并噻吩基、萘并 噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶 基、吡嗪基、吲哚基、嘌呤基、喹啉基等。杂环基包括四氢呋喃、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内 酯和内酰胺等。
[0024] 在某些实施方案中，极性或带电残基可以被引入肽环氧化物或肽氮丙啶。举例来 讲，可以引入天然氨基酸，例如含羟基（Thr、Tyr、Ser)或硫（Met、Cys)的氨基酸，以及非必 需的氨基酸，例如氨基乙磺酸、肉毒碱、瓜氨酸、胱氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸等。也可以包含 非天然的含带电或极性部分的侧链取代基，例如含一个或多个羟基、短链烷氧基、硫基、硫 代、羧基、酯基、二氧磷基、酰胺基或氨基的Q6烷基或C6 12芳基，或者被一个或多个卤原子 取代的上述取代基。在某些优选实施方案中，在肽部分的侧链上存在至少一个芳基。
[0025]在部分实施方案中，主链单元为酰胺单元[-NH-CHR-C( = 0) _]，其中R为侧链。这 样的标示没有排除天然的氨基酸脯氨酸或其它非天然的环状仲氨基酸，本领域技术人员能 够理解这一点。
[0026] 在其它实施方案中，主链单元为N-烷基化酰胺单元（例如N-甲基等）、烯烃类 似物（其中一个或多个酰胺键被烯键替代）、四唑类似物（其中四唑环使主链呈顺式构 型）、或者这些主链键的组合。在另外一些实施方案中，氨基酸α-碳被α-烷基取代修 饰，例如氨基异丁酸。在另外一些实施方案中，侧链被局部修饰，例如通过4￡或△ Ζ脱氢 修饰，其中双键位于侧链的α和β原子之间，或者例如通过△ζ环丙基修饰，其中 环丙基位于侧链的α和β原子之间。在另外一些利用氨基酸基团的实施方案中，可以 使用D-氨基酸。其它实施方案可以包括侧链与主链环化、形成二硫键、形成内酰胺、形成 偶氮键以及下述文献阐述的其它修饰：Hruby和Boteju:"PeptidesandMimics，Design ofConformationallyConstrained'，，RobertA.Meyers主编：''MolecularBiologyand Biotechnology：AComprehensiveDeskReference'，，VCHPublishers(1995)，p. 658-664， 通过引用结合到本文中。
[0027] 本发明一方面涉及具有式（I)结构的化合物或其药学可接受的盐：
[0028]
[0029] 其中
[0030]L选自C= 0、C=S和S02，优选C= 0;
[0031]X选自 0、S、NH和N-C! 6烷基；
[0032]Z表示不存在、Q6烷基或Ci6烷氧基，优选不存在；
[0033]R1、R2和R3各自独立选自氢、C i6烷基、C i6烯基、C i6炔基、C i6羟基烷基、C i6烷氧 基烷基、芳基、Ci6芳烷基、杂芳基、杂环基、ci6杂环烷基、ci6杂芳烷基、碳环基和ci6碳环 烷基；
[0034] R4选自氢、C i6芳烷基和C i6烷基；
[0035] R5为杂芳基；和
[0036] R6和R7独立选自氢、C i6烷基和C i6芳烷基。
[0037]在某些实施方案中，R1、R2和R3独立选自氢、Ci6烷基、Ci6羟基烷基、Ci6烷氧基烷 基、Q6芳烷基、Ci6杂环烷基、Ci6杂芳烷基和Ci6碳环烷基。在某些实施方案中，R\R2和 R3中的任个独立为选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和异丁基的Ci6烷基。在 某些实施方案中，R\R2和R3中的任一个独立为Ci6羟基烷基。在某些优选的此类实施方案 中，R\R2和R3中的任一个独立选自羟甲基和羟乙基，优选羟甲基。在某些实施方案中，R1、 R2和R3中的任一个独立为Ci6烷氧基烷基。在某些此类实施方案中，R1、R2和R3中的任一 个独立选自甲氧基甲基和甲氧基乙基，优选甲氧基甲基。在某些实施方案中，R\R2和R3中 的任一个独立为Q6杂芳烷基。在某些此类实施方案中，R1、R2和R3中的任一个独立选自咪 唑基甲基、吡唑基甲基、噻唑基甲基和吡啶基甲基，优选咪唑-4-基甲基、噻唑-4-基甲基、 2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基或4-吡啶基甲基。在某些实施方案中，R\R2和R3中的任一 个独立为C16芳烷基。在某些此类实施方案中，R\R2和R3中的任一个独立选自苯基甲基 (苄基）和苯基乙基，优选苯基甲基。在某些实施方案中，R\R2和R3中的任一个独立为C16 碳环烷基。在某些此类实施方案中，R1为环己基甲基。在某些实施方案中，R\R2和R3均不 同。在某些实施方案中，R\R2和R3中的任两项相同。在某些实施方案中，R\R2和R3均相 同。
[0038] 在某些实施方案中，R1和R2中的至少一个选自C i6羟基烷基和C i6烷氧基烷基。 在某些此类实施方案中，R1和R2中的至少一个为烷氧基烷基。在某些此类实施方案中，R1 和R2中的至少一个选自甲氧基甲基和甲氧基乙基。
[0039]在某些实施方案中，R3选自C i6烷基和C i6芳烷基，优选C i6烷基。在某些此类实 施方案中，R3选自甲基、乙基、异丙基、仲丁基和异丁基。在某些此类实施方案中，R3为异丁 基。在某些可供选择的实施方案中，R3选自苯基甲基和苯基乙基，优选苯基甲基。
[0040] 在某些实施方案中，R4、R6和R7独立选自氢和甲基，优选氢。
[0041]在某些实施方案中，R5为5-或6-元杂芳基。在某些此类实施方案中，R5选自异 II唑、异噻唑、呋喃、噻吩、囉唑、噻唑、吡唑或咪唑，优选异囉唑、呋喃或噻唑。
[0042] 在某些实施方案中，R5为双环杂芳基。在某些此类实施方案中，双环杂芳基选自苯 并异啸:唑、苯并fl:唑、苯并噻唑或苯并异噻唑。
[0043] 在某些实施方案中，L为C= 0，Z不存在，R5为异輕;唑-3-基或异囉唑-5-基。在 某些优选的此类实施方案中，当异_唑-3-基被取代时，其至少在5-位被取代。在某些优 选实施方案中，当异曝唑-5-基被取代时，其至少在3-位被取代。
[0044]在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为未取代的异噁唑-3-基。
[0045] 在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为取代的异_唑-3_基。在 某些此类实施方案中，R5为被选自C16烷基、C16烷氧基、C16烷氧基烷基、C16羟基烷 基、羧基（carboxylicacid)、氨基甲酰基（aminocarboxylate)、C16烷基氨基甲酰基 (Q6alkylaminocarboxylate)、（Q6烷基）2氨基甲酰基（（C丄 6alkyl)2aminocarboxylate)、 Q6烷氧基羰基（Ci6alkylCarb〇Xylate)、Q6杂芳烷基、Ci6芳烷基、Ci6杂环烷基和Ci6碳 环烷基的取代基取代的异嗯唑-3-基。在某些优选的此类实施方案中，R5为被选自甲基、 乙基、异丙基和环丙基甲基的取代基取代的异曝唑-3-基。
[0046]在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为被4-至6-元含氮C16杂环烷基 取代的异丨唑-3-基。在某些此类实施方案中，R5为被氮杂环丁基甲基（优选氮杂环丁 烷-1-基甲基）取代的异曙唑-3-基。在某些可供选择的此类实施方案中，L为C= 0,Z 不存在，R5为t
取代的异囉唑-3-基，其中W为0、NR或CH2,R为Η或Q6烷 基。在某些此关头施力菜甲，W为0。
[0047]在某些实施方案中，L为C= 0,Ζ不存在，R5为被5-元含氮Ci6杂芳烷基（例如 吡唑基甲基、咪唑基甲基或三唑-5-基甲基，优选1，2,4-三唑-5-基甲基）取代的异_ 唑-3-基。
[0048]在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为被Ci6烷氧基或Ci6烷氧基烷基 (优选甲氧基、乙氧基、甲氧基甲基或甲氧基乙基）取代的异囉唑-3-基。
[0049]在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为被Ci6羟基烷基（优选羟甲基或羟 乙基）取代的异囉唑-3-基。
[0050] 在某些实施方案中，L为C= 0，Z不存在，R5为被羧基、氨基甲酰基、q6烷基氨基 甲酰基、6烷基）2氨基甲酰基或Ci6烷氧基羰基取代的异螺唑-3-基。在某些此类实施 方案中，R5为甲氧基羰基或乙氧基羰基，优选甲氧基羰基取代。
[0051]在某些实施方案中，L为C= 0，Z不存在，R5为未取代的异唑-5-基。
[0052] 在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为取代的异罐唑-5-基。在某些此 类实施方案中，R5为被选自Ci6烷基、Ci6烷氧基、Ci6烷氧基烷基、Ci6羟基烷基、羧基、氨基 甲酰基、Q6烷基氨基甲酰基、（Ci6烷基）2氨基甲酰基、Ci6烷氧基羰基、Ci6杂芳烷基、Ci6 芳烷基、Q6杂环烷基和Ci6碳环烷基的取代基取代的异:囉唑-5-基。在某些优选的此类 实施方案中，R5为被选自甲基、乙基、异丙基和环丙基甲基的取代基取代的异:囉唑-3-基。
[0053] 在某些实施方案中L为C= 0,Z不存在，R5为被4-至6-元含氮Ci6杂环烷基取代 的异囉唑-3-基。在某些此类实施方案中，R5为被氮杂环丁基甲基（优选氮杂环丁烷-1-基 甲基）取代的异嚼唑-5-基。在某些可供选择的此类实施方案中，L为C= 0，Z不存在，R5 为I
Z代的异_唑-3-基，其中W为0、NR或CH2,R为Η或Q6烷基。在某 些此类实施方案中，W为0。
[0054]在某些实施方案中，L为C= 0,Ζ不存在，R5为被5-元含氮Ci6杂芳烷基（例如 吡唑基甲基、咪唑基甲基或三唑-5-基甲基，优选1，2,4-三唑-5-基甲基）取代的异囉 唑-5-基。
[0055]在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为被Ci6烷氧基或Ci6烷氧基烷基 (优选甲氧基、乙氧基、甲氧基甲基或甲氧基乙基）取代的异喔唑-5-基。
[0056] 在某些实施方案中，L为C= 0,Z不存在，R5为被Ci6羟基烷基（优选羟甲基或羟 乙基）取代的异囉唑-5-基。
[0057] 在某些实施方案中，L为C= 0，Z不存在，R5为被羧基、氨基甲酰基、q6烷基氨基 甲酰基、6烷基）2氨基甲酰基或Ci6烷氧基羰基取代的异囉唑-3-基。在某些此类实施 方案中，R5为甲氧基羰基或乙氧基羰基，优选甲氧基羰基取代。
[0058] 在某些实施方案中，式I化合物选自以下化合物：
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]