一种抗菌肽hjh-3及其应用

文档序号:9484119阅读:928来源:国知局
一种抗菌肽hjh-3及其应用
【技术领域】:
[0001] 本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种抗菌肽HJH-3及其应用。 二、
【背景技术】:
[0002] 近年来,抗生素的滥用使药物残留和细菌耐药性问题日渐突出,严重威胁着畜 牧业发展和人类健康,致使新型抗菌药物的研发变得更为迫切。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物机体在抵御病原微生物时产生的一类防御性小肽,是生物免疫防御 系统的重要组成部分。与传统抗生素相比,抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗 菌谱广,不易诱发细菌产生耐药性,不会产生药物过敏反应等优点,是目前国际上公认的抗 生素最佳替代品。
[0003] 然而,天然抗菌肽也并非是完美的,大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高,且在发 挥抑菌效果的同时往往对正常的真核细胞也产生毒性,以及溶血作用,这都限制了抗菌肽 的发展应用。因此,目前对抗菌肽的研究重点在于,通过对人工设计的一系列不同抗菌肽类 似物的研究,探明其抑菌、细胞毒性、溶血活性的机制,从而为获得抑菌活性高、对正常真核 细胞低毒甚至无毒性、无溶血性,高效、安全的抗菌肽奠定理论基础。
[0004]目前为止,发现的抗菌肽已有2000多种。已测定了几百种不同抗菌肽的氨基酸序 列,这些抗菌肽在长度、结构、序列上各有明显的不同,抗菌肽大多由20~40个氨基酸残基 组成,且其一级结构具有明显的特征即:肽链中间富含Pro,C端富含Gly、Val和Ala等非 极性氨基酸,而N端多含Arg、LyS等极性的氨基酸。因此,他们都表现两个共同的特征:阳 离子肽;活性结构为两亲性。目前对抗菌肽的作用机理还没有统一的认识;但是,大多数的 理论都认为其作用机制与其阳离子性和疏水性有关。因此,为了获得安全、高效的抗菌肽, 本发明主要根据氨基酸的离子性和疏水性,发明了一种抗菌肽HJH-3。 三、

【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是:提供一种抗菌肽HJH-3及其应用。本发明抗菌肽 HJH-3含有18个氨基酸残基,不产生溶血性,抗菌谱广,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真 菌均具有高效的抗菌作用。所以,本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革 兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
[0006] 为了解决上述问题,本发明采取的技术方案为:
[0007] 本发明提供一种抗菌肽HJH-3,所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列为缬氨酸-天冬酰 胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬 氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸(SEQIDNO:1)。
[0008] 根据上述的抗菌肽HJH-3,所述抗菌肽HJH-3为直链多肽,含有18个氨基酸残基, 2077. 52Da,等电点为 11. 05。
[0009] 另外,提供一种上述的抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌 或/和真菌疾病药物中的应用。
[0010] 本发明的积极有益效果:
[0011] 本发明产品抗菌肽HJH-3为直链多肽,含有18个氨基酸残基,2077. 52Da,等电点 11. 05;并且本发明产品不产生溶血性,抗菌谱广,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都 具有高效的抗菌作用。所以,本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
[0012] 本发明抗菌肽HJH-3采用自动多肽合成仪进行固相化学合成法合成,合成方向是 从C端到N端逐一进行,其制备的详细步骤如下:
[0013]a、树脂的溶涨:首先将Fmoc-Leu-Wangresin树脂加入自动多肽合成仪反应器 内,并自动加入二甲基甲酰胺DMF进行溶涨,lgFmoc-Leu-Wangresin树脂加入DMF的量 约为12mL(保证溶剂DMF能够完全浸没树脂),溶涨时间为10~30min(溶涨可重复1~2 次);
[0014]b、脱保护:树脂溶涨后,按照设定将储罐内的20%哌啶(20%哌啶的配制方法: 哌啶溶于二甲基甲酰胺DMF中配制而成的)自动加入到反应器内浸没溶涨后的树脂(lg Fmoc-Leu-Wangresin树脂需要加入20%哌啶约为10mL),使其溶涨后的树脂进行脱保护 (脱保护的时间约为30min),脱保护后自动加入二甲基甲酰胺进行洗涤;
[0015]c、接着按照抗菌肽HJH-3氨基酸序列的排序自动加入第二种氨基酸组氨酸 Fmoc-His,并自动加入缩合剂HCTU(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)和 催化剂NMM或DIEA(NMM中文名称为N-甲基吗啡啉,DIEA中文名称为N,N二异丙基乙胺) 进行缩合反应;反应结束后自动加入二甲基甲酰胺DMF进行反复洗涤,除去未反应的氨基 酸;
[0016] 所述组氨酸与Fmoc-Leu-Wangresin树脂的摩尔比为5:1;所述缩合剂HCTU与组 氨酸Fmoc-His二者之间的摩尔比为1:1;所述催化剂NMM或DIEA与组氨酸二者之间的摩 尔比为4:1;
[0017] 洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤,依照步骤c上述同样方 法依次自动加入氨基酸Fmoc-Ser、Fmoc-Arg、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、 Fmoc-Leu、Fmoc-Ser、Fmoc-His、Fmoc-Ser、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys、Fmoc-Pro、 Fmoc-Asn-和Fmoc-Val进行缩合反应、洗涤,最后一个氨基酸缩合反应、洗涤后,得到多肽 产物;每次缩合反应、洗涤后所得产物均按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤,然后自动 加入下一个氨基酸进行缩合反应、洗涤(每次缩合反应中,所加入氨基酸与Fmoc-Leu-Wang resin树脂的摩尔比均为5:1;所述缩合剂HCTU与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为 1:1 ;所述催化剂NMM或DIEA与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为4:1);
[0018]d、多肽产物的脱保护和裂解:在步骤c所得多肽产物中自动加入20%哌啶到反应 器内浸没多肽产物(对lg树脂进行脱保护使用20%哌啶的量约为10mL),使其多肽产物进 行脱保护,脱保护后依次自动加入二甲基甲酰胺DMF、二氯甲烷DCM进行反复洗涤;
[0019] 洗涤后自动加入三氟乙酸TFA进行裂解(对lg树脂进行裂解使用的裂解液TFA 的体积约为20mL),通过裂解使得多肽从树脂上裂解下来,裂解后进行过滤(使用砂心漏斗 进行过滤),得到滤液;
[0020] e、合成多肽的沉淀:
[0021]裂解过程结束后,为从三氟乙酸(TFA)裂解后得到的滤液中得到合成的多肽产 物,采用冷乙醚对所得滤液进行洗涤离心沉淀的方法,其具体操作过程为:在步骤d得到的 滤液中加入3倍体积4°C保存的冷乙醚,密封后颠倒混匀,冰浴lOmin,在4000r/m下离心 lOmin,回收剩余沉淀,弃上清液体;重取4°C保存的冷乙醚重悬沉淀;上述步骤反复三次, 然后将所得沉淀干燥12~16h,得到合成肽粗品;
[0022] f、合成肽粗品的纯化:采用半制备型高效液相色谱仪为P2000对合成肽粗品进 行过柱纯化,收集纯度多95%的馏分,即得到纯化后的抗菌肽HJH-3,其产品纯度抗菌肽 HJH-3的纯度彡95% (详见附图1分析)。
[0023] 半制备型高效液相色谱仪为P2000是由北京沃华创新科技有限公司提供,其色 谱柱为C18反相柱(4. 6*250mm),洗脱液(流动相)为A溶液0. 1 %的三氟乙酸乙腈溶液 (0.lmL的三氟乙酸定容到lOOmL乙腈溶液中)和B溶液0. 1%的三氟乙酸水溶液(0.lmL 的三氟乙酸定容到100mL去离子水中),使用上述处理柱,上样后25min内A溶液的比例由 27%逐步调至52%,B溶液的比例由73%逐步调至48%,25.lmin时,A溶液的比例变为 100%,B溶液变为0%,以lmL/min的流速进行30min的分离,检测波长为220nm,收集纯度 彡95%的馏分(详见附图1所示);
[0024] 本发明所得抗菌肽HJH-3产品的确认鉴定:
[0025] (1)采用分析型液相色谱质谱联用仪(WatersmicromassZQ-2000)测定所得产品 抗菌肽HJH-3的分子量,经测定:其分子量为2077. 52Da,结果详见附图2。
[0026] 质谱测定条件:采用正离子化模式,其毛细管电压为3. 00KV,毛细管出口电压 50V,碎裂电压为5V,干燥气流量为1. 5L/min,干燥气温度为350°C,扫描范围为400~ 1900m/z〇
[0027] (2)氨基酸序列结构测定:采用自动氨基酸测序仪测定本发明产品抗菌肽HJH-3 的氨基酸序列结构,经测定:HJH-3是直链多肽,含有18个氨基酸残基;HJH-3的全序列为: 缬氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨 酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸(即Val-Asn -Pr〇-Lys-Leu-Leu-Ser-His-Ser-Leu-Leu-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-His-Leu)〇
[0028] (3)等电点分析:
[0029]打开DNAStar软件中的EditSeq,打开file,点击"new"中的"newprotein",输入 本发明产品HJH-3的氨基酸序列,即可以获得等电点数据。经分析:HJH-3抗菌肽类似物的 等电点为11.05。 四、【附图说明】:
[0030] 图1本发明抗菌肽HJH-3产品的高效液相色谱图;
[0031] 图2本发明抗菌肽HJH-3产品的质谱图;
[0032]图3本发明抗菌肽HJH-3产品临床分离耐药菌株的抑菌活性测定图;
[0033] 图4本发明抗菌肽HJH-3产品的细菌形态结构影响分析图。
[0034] 图4中:a、b、c分别为对数生长期的正常培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念 珠菌的电镜扫描图;A、B、C分别为抗菌肽HJH-3作用后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色 念珠菌的电镜扫描图。 五、【具体实施方式】:
[0035] 以下结合实施例进一步阐述本发明,但并不限制本发明的内容。
[0036] 实施例1 :
[0037] 本发明抗菌肽HJH-3产品为SEQ I
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