芽孢杆菌dy26-004及其在防治植物致病真菌的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一株芽孢杆菌DY26-004及其在制备防治植物 致病真菌发酵上清液中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物病害一直是影响农业生产的重要因素之一，化学农药的长期大量使用不仅催 生了病原菌的抗药性，而且农药残留对人、畜和环境都有危害。生物防治是利用有益生物 或其产物来抑制或消灭有害生物的一种方法，由于其无毒害、无污染和不易产生抗药性的 优点，使其成为防治植物病害研究中的一个新方向（Calvoetal. 2007)。细菌由于生长周 期短，代谢易于调控，可通过发酵实现大规模生产的特点，被广泛应用于植物病害防治的研 究。芽胞杆菌（Bacillus)、假单胞菌（Pseudomonas)、节杆菌（Arthrobacter)和沙雷氏菌 (Serratia)等都在控制植物真菌性病害上具有明显效果（BashaandUlaganathan. 2002)。
[0003]目前用于生物防治的微生物菌株多数来自于陆地，而多年来对陆地微生物的筛 选，导致筛选到产生新型抗病机制的微生物越来越少。因而人们逐渐把目光投向了海洋，希 望从海洋环境中开发出新型抗病原菌活性物质，用于植物病害的生物防治。海洋微生物相 对于陆地微生物而言，一直处于海洋特有的高盐、高压、低氧、低光照等极端条件，导致其在 物种、基因组成和生态功能上的多样性（李越中，陈琦.1998)。海洋微生物活性物质的开 发利用研究进展迅速，人们已从放线菌、真菌、细菌、微藻等海洋微生物中分离出具有抗肿 瘤、抗菌、免疫调节功能以及其它用途的生物活性物质。
[0004] 据报道，芽孢杆菌对多种由植物病原真菌所引起的植物病害具有良好的拮抗和 防治效果。在水稻中，由立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani)引起的纹枯病、由稻梨孢 (Magnaporthegrisea)引起的稻痕病；在谷物中，由禾白粉菌（Erysipheraminis)引起 的禾谷类白粉病等；在蔬菜中由灰葡萄孢（Botrytiscinerea)引起的灰霉病、由尖镰孢菌 (Fusariumoxysporum)引起的枯萎病以及由瓜果腐霉（Pythiumaphanidermatum)引起的 根腐病，等。由此可见，芽孢杆菌是筛选拮抗植物病原真菌生防菌有效来源之一（齐爱勇， 等·2011)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一株芽孢杆菌（Bacillussp. )DY26_004。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种芽孢杆菌（Bacillussp.)DY26-004在制备防治 植物致病真菌发酵上清液中的应用。
[0007] 所述芽孢杆菌（Bacillussp.)DY26-004分离自中国第26次大洋科学考查所采集 的沉积泥样品（S003站点；w63° 45. 3496'，S3。39. 8693');该菌已于2015年6月27 日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大 学，邮编430072,保藏中心保藏编号为CCTCCNO:M2015406。
[0008] 通过聚合酶链式反应（PCR)扩增DY26-00416SrDNA序列，与美国国家生物技 术信息中心（NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属(Bacillussp.)具有99%的序列相似性；其16SrDNA序列的GenBank登录号为KT270352。
[0009] 所述芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26_004的16SrDNA部分序列如下：
[0010]
[0012] 所述芽孢杆菌（Bacillussp.)DY26-004可在制备防治植物致病真菌发酵上清液 中应用。
[0013] 所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：
[0014] 将芽孢杆菌（Baci1lussp. )DY26-004放入种子培养基培养，得芽孢杆菌 DY26-004种子液，再接入到液体发酵培养基中培养，发酵结束后离心，除去沉淀菌体，即得 防治植物致病真菌发酵上清液。
[0015] 所述种子培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 121°C高灭压菌20min。
[0016] 所述液体发酵培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，121°C高灭压菌20min。
[0017] 所述放入种子培养基培养的条件可在28~30°C，转速180~220r/min下，培养 12 ~24h〇
[0018] 所述接入到液体发酵培养基中培养的芽孢杆菌DY26-004种子液的接入量与液体 发酵培养基的体积比可为1 : 1〇〇,所述接入到液体发酵培养基中培养的条件可为28~ 30°C，转速180~220r/min，培养48~72h。所述离心的条件可在10000r/min下离心 15 ~20min〇
[0019] 所述植物致病真菌包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄 链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。在油菜菌核病菌（核盘 菌）和小麦赤霉病（镰刀菌）防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，防效分别为65% 和 72%〇
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：芽孢杆菌（Bacillussp.)DY26-004对多 种植物病害的防治有明显效果，抑真菌谱广、抑菌效果明显、发酵培养基简单。
【附图说明】
[0021] 图1为芽抱杆菌（Bacillussp. )DY26-004的菌落形态。
[0022] 图2为芽孢杆菌（Bacillussp.)DY26-004的发酵上清液对不同植物致病真菌的 抑菌效果图。在图2中：A，长柄链格孢；B，绿色木霉；C，香蕉炭疽菌；D，核盘菌；E，立枯丝核 菌；F，镰刀菌；G，宛氏拟青霉；Η:互生链格孢；I:镰刀菌；J:香蕉炭疽菌。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0024] 实施例1 :芽孢杆菌（Bacillussp. )DY26_004的分离筛选
[0025] 本发明涉及芽孢杆菌（(Bacillussp. )DY26_004由本申请人从中国第26次大洋 科学考查所采集的沉积泥样品中所分离获得，该菌在LB培养基上生长，28°C培养24h后，菌 体呈水滴状，浅白色，菌落较大，见图1。
[0026] 实施例2 :芽孢杆菌（Bacillussp. )DY26_004菌种鉴定
[0027]采用16SrRNA基因测序方法对芽孢杆菌DY26-004进行菌种鉴定。利 用通用引物扩增大洋来源菌株DY26-004 16SrDNA序列，正向引物27F序列为： AGAGTTTGATCCTGGCTCAT，反向引物 1492R序列为：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。以芽孢杆菌 DY26-004总DNA为PCR扩增模板，进行PCR反应。反应条件为：94 °C变性lmin;55 °C退 火lmin;72°C延长1.5min，30个循环。扩增基因送测序公司测序，获得该菌株16SrDNA 序列后，将该序列通过美国国家生物技术信息中心（NCBI)与GeneBank中核酸数据进行 对比分析(http: //ncbi.nlm.n