一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于 遗传工程领域。
【背景技术】
[0002] 乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及 动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软 骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加 来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目 前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污 染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
[0003] 枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化 学品的生产宿主，其产品被FDA认证为"generallyregardedassafe"（GRAS)安全级别。 201510394205. 7构建的重组枯草芽孢杆菌（BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNAl)可在合成培养基中 较快生长、发酵生产乙酰氨基葡萄糖，但是存在乙酰氨基葡萄糖产量（3g/L)较低的缺点。 因此，如何提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量以进一步提高GlcNAc产量，是提高乙酰 氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨 基葡萄糖的方法。由于培养基中含有葡萄糖时，枯草芽孢杆菌主要采用磷酸转运途径转运 葡萄糖，利用磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸根将培养基中葡萄糖磷酸化并转运至胞内，在该过 程中会产生大量的丙酮酸，而且磷酸烯醇式丙酮酸还可以通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 转化为丙酮酸。所以本发明通过阻断宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反 应，减少流向三羧酸循环的碳通量，最终提高了乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量、提高 GlcNAc产量。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌， 所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编 码基因（pckA)，命名为重组枯草芽孢杆菌BSGNKA。
[0006]所述枯草芽抱杆菌BSGNK，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagB ΔldhΔpta: :lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNAl的重组表达，并在此 基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK(NCBI上GeneID:938206)。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，通过pP43_GNAl质粒游离表达GNA1基因，通过 pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
[0008]在本发明的一种实施方式中，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔη agBMdhApta: :1οχ72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达的 重组菌命名为BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl，具体构建方法可参见文献Liu，Y.etal.Modular pathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamine production.Metab.Eng. 23:42-52, 2014〇
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNK，是专利申请 201510394205. 7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是 NCBI中geneID:937235所示的基因。
[0011] 本发明第二个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是先构建磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框，经同源重组将敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替 代枯草芽孢杆菌BSGNK基因组中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷 酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基 葡萄糖积累。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述敲除框的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0013] 本发明的第三个目的是提供一种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法， 是以所述重组枯草芽孢杆菌BSGNKA为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵，使用的发酵培养基按g/L计，含有：初始 葡萄糖 20,蛋白胨 6,酵母粉 12,（NH4)S046,Κ2ΗΡ04 · 3H20 12. 5,ΚΗ2Ρ042· 5,CaC035,微量元 素溶液l〇_15ml;其中微量元素溶液按g/L计含有：MnS04 · 5H20 1. 0,CoCl2 · 6H20 0. 4， NaMo04 · 2H20 0· 2,ZnS04 · 7H20 0· 2,Alcl3 · 6H20 0· 1，Cucl2 ·H20 0· 1，Η3Β040 · 05,含 5M HC1 (即1L微量元素溶液中含有5molHC1)。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵，是将生产菌株活化后，以3%的接种量转 入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于3L发酵罐、35-37°C、600-800rpm条件下培养 52-72h〇
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明的重组枯草芽孢杆菌BSGNKA，是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上敲除磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因（pckA)得到的，与出发菌株BSGNK相比，其乙酰氨基葡萄糖 胞外积累量提高了28.1%，浓度可达到29.27g/L。同时，本发明的BSGNKA菌株的乙酰氨基 葡萄糖比合成速率比对照菌株BSGNK提高了 46. 5%，副产物乙偶姻的产量仅为对照菌株的 68. 5%。本发明通过敲除pckA基因，可以有效的减少副广物生成，提尚GlcNAc的积累。本 发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0018] 乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
[0019] 高效液相色谱（HPLC)检测法：Agilent1200,RID检测器，順2柱（250X4.6mm， 5μm)，流动相：70%乙腈，流速0. 75mL/min，柱温30°C，进样体积为10μL。
[0020] 发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。
[0021] 种子培养基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10。
[0022] 发酵培养基（g/L)，为合成培养基：初始葡萄糖20,蛋白胨6,酵母粉12,（NH4) S046, Κ2ΗΡ04 ·