一种诱导3t3-l1前脂肪细胞分化的试剂组合及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体地说是一种促进3T3-L1前脂肪细胞分化的组合物及其在前脂肪细胞诱导分化中的应用。
【背景技术】
[0002]前脂肪细胞是一类具有向脂肪细胞分化潜力的特异性的前体细胞，由多能干细胞或胚胎干细胞分化生成。脂肪细胞是白色脂肪组织(WAT)的主要成分，其本身不能增殖，主要通过前脂肪细胞在各种激素作用下诱导而成。在开始向脂肪细胞分化前，前脂肪细胞形态上类似成纤维细胞，呈长梭形。开始分化后，前脂肪细胞逐渐变圆，同时细胞内甘油三脂的含量逐渐上升，细胞骨架蛋白等的含量下降。细胞内开始出现脂滴，前脂肪细胞逐渐向成熟脂肪细胞转化。
[0003]动物的前脂肪细胞作为肥胖疾病和糖尿病疾病研究的细胞模型，常用于体外筛选治疗上述两种疾病的药物。3T3-L1前脂肪细胞是Green和Kehinde于1974年从Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分离出的一种具有分化潜力的细胞株，能在适当的诱导条件下分化为成熟的脂肪细胞。目前，该细胞株已作为体外研究脂肪代谢调控的最常用的细胞模型之一，广泛地应用于脂肪代谢疾病和新药开发等领域的科学研究中。
[0004]经典“激素鸡尾酒法”被大量运用于前脂肪细胞诱导分化中，其主要成分仅含有IBMX、地塞米松和胰岛素。在胰岛素、地塞米松和IBMX的刺激下，可通过增加细胞内第二信使一cAMP的浓度，促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞。
[0005]三磷酸腺苷除了作为细胞内能量传递的重要能量物质。在细胞外还可以作为信号分子，与P 2 (腺嘌呤核苷酸)受体结合参与跨膜信号传导，发挥其多种生理功能。其在癌症治疗、炎症控制上有着广阔的前景。
【发明内容】
[0006]
本发明的目的在于提供一种试剂组合可显著促进脂肪细胞3T3 -LI分化，具体是是促进自体前脂肪细胞分化及脂滴形成的组合物及其应用。
[0007]为实现本发明的上述目的，本发明提供如下的技术方案:
配方成分:
A诱导分化液:
(I)三磷酸腺苷终浓度 0μΜ，50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ 和 200μΜ。
[0008](2)地塞米松终浓度?μΜ。
[0009](3)胰岛素终浓度850ηΜ。
[0010](4) IBMX终浓度 0.25 ηΜ。
[0011]B维持培养液:
(I)三磷酸腺苷终浓度 ΟμΜ，50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ 和 200μΜ。
[0012](2)胰岛素终浓度850nM。
[0013]三磷酸腺苷是各种活细胞内普遍存在的一种高能磷酸化合物。在体内组织细胞中作为一切生命活动所需能量的直接来源，储存和传递化学能，当体内吸收、分泌、肌肉收缩及进行生化合成反应需要能量时，三磷酸腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基，同时释放能量。三磷酸腺苷亦能作为一种辅酶，增强细胞的代谢活性，参与蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成和代谢。在细胞外与P2受体特异性结合，调节细胞生理功能。
[0014]在体外实验中，小鼠前脂肪细胞3T3-L1作为常用实验材料，常通过经典的“激素鸡尾酒法”将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。成熟的脂肪细胞与前脂肪细胞相比，形态变大变圆，通过染色可以看见明显的脂滴。在分化过程中加入本发明，发现在一定浓度情况下可以显著促进3T3-L1细胞的分化。在已有关于三磷酸腺苷的报道中未见其对前脂肪细胞分化显著影响的报道。本发明可以有效促进前脂肪细胞分化，对加快前脂肪细胞的诱导分化有很好的运用前景。
【附图说明】
[0015]图1为人工诱导3T3- LI前脂肪细胞分化过程示意图。
[0016]图2为不同浓度三磷酸腺苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响(油红O染色)。
[0017]图3为三磷酸腺苷对3T3 -LI脂肪细胞内甘油三酯含量的影响(尼罗红染色)。
[0018]图4为Image-pro Plus6.0图像处理软件对3T3- LI脂肪细胞内脂滴数、脂滴总面积、脂滴平均面积、脂滴直径、数量等指标的统计结果。
[0019]图5为3T3 -LI脂肪细胞内脂滴平均直径统计结果。
[0020]图6为3T3 -LI脂肪细胞内脂滴平均面积统计结果。
【具体实施方式】
[0021]本实施例用到的各种实验仪器实验仪器:
超净工作台(Thermo，美国)、酶标仪(Thermo，美国)、冷冻离心机(Eppendorf，德国)、高压灭菌锅:(Tomy，日本)、细胞CO2培养箱(Thermo，美国)、倒置显微镜(Olympus 1X71，日本)、移液枪(Eppendorf，德国)、电子天平(赛多利斯公司，美国)、去离子水系统(Mi I Ipore，美国)。
[0022]实验试剂:
胎牛血清(Gibco，美国)、DMEM /High Glucose 培养基(Hyclone，美国)、IBMX(Sigma，美国)、地塞米松(Sigma，美国)、胰岛素(Sigma，美国)、三磷酸腺苷(sigma，美国)、Na0H溶液、油红O染料0、？83 0^10加，美国)、尼罗红染料(Lonza，美国)、10%多聚甲醛、75%酒精、超纯水、滤纸、48孔板(Coring，美国)、0.25%胰酶(Hyclone，美国)、无水异丙醇、细胞培养瓶(Coring，美国)、Hepes缓冲剂(Sigma，美国)。
[0023]实施例1:所需各种试剂的配制:
(I)胰岛素溶液配制:
将1mg胰岛素干粉溶解于0.02M HCl溶液，得到1.7mM胰岛素溶液；取0.1ml 1.7mM溶液加入0.9ml基础培养液中成170μΜ胰岛素溶液。
[0024](2)地塞米松溶液配制: 取地塞米松干粉3.925mg溶解于Iml无水乙醇中，得到1mM地塞米松；取0.1ml1mM的地塞米松加入0.9ml PBS中成为ImM的地塞米松溶液。
[0025](3) IBMX 溶液配制:
将5.56mg IBMX干粉溶解于0.5ml的KOH (0.5M)溶液中，得到50mM IBMX溶液。
[0026](4)完全培养液配制:
取DMEM(High Glucose)培养液一瓶500ml，加入胎牛血清(FBS) 55ml以及1.38gHepes缓冲剂，用lmol/L NaOH溶液调pH=至7。用0.22 μ m的微孔过滤器除菌，装入500ml培养液瓶。
[0027](5)诱导分化培养液: