抗蓝舌病病毒ns1蛋白的群特异性单克隆抗体btv-ns1-1f11及其识别的b细胞表位和应用

文档序号:9485155阅读:453来源:国知局
抗蓝舌病病毒ns1蛋白的群特异性单克隆抗体btv-ns1-1f11及其识别的b细胞表位和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株分泌抗1-24型蓝舌病病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 及其所分泌的单克隆抗体;本发明还涉及由上述单克隆抗体所识别的BTVNS1蛋白的线性 B细胞表位;本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及线性B细胞表位在制备鉴别 诊断以及预防与治疗BTV相关试剂与药物中的应用。本发明属于蓝舌病的防治领域。
【背景技术】
[0002] 蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)是呼肠孤病毒科环状病毒属的典型成员。 BTV以库蚊为媒介,通过叮咬野生和家养等反刍动物,包括绵羊,山羊和牛,而使之感染。由 于BTV中存在大量的基因变异和抗原变异,目前世界上已经发现26种不同BTV血清型,且 各个血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护作用,这给蓝舌病(BT)的检测和防控带来了极 大的困难。世界动物卫生组织(0ΙΕ)将BT列为法定通报性疾病,我国将其划定为一类动物 疫病。
[0003] 本病于19世纪在南非的绵羊中首次发现,1905年被命名为"蓝舌病",现已确定 BTV有26个血清型。从1998年开始蓝舌病病毒开始在全球范围内蔓延,主要发生在世界 上热带和温带范围内的大部分地区,其流行病学与作为BTV生物传播载体的特定库蠓的分 布相吻合。但是近几年来由于全球气候变暖,BT在全球范围内的流行趋势不容乐观。从 1998-2006年,BTV1、2、4、8、9以及16型扩散传播到地中海沿岸的欧洲地区。欧洲许多国 家如比利时、法国、德国、卢森堡和荷兰等国家都有过BT爆发的报道,造成了巨大的经济损 失,这不仅包括因动物死亡和繁殖能力降低而造成的直接损失,还包括在BTV感染区和非 感染区之间设立关卡、屏障而限制了反刍动物及动物制品交易而造成的间接损失。我国 于1979年首次在云南省师宗县确定蓝舌病的发生,之后相继在湖北省(1983年)、安徽省 (1985年)、四川省(1989年)、山西省(1991年)爆发过本病。从1994-1997年,先后对我 国29个省区蓝舌病血清学进行调查,鉴定出BTV1、2,、3、4、12、15以及16等7个血清型, 其中BTV1、16型在自然感染发病绵羊体内分离获得,是主要的致病血清型。因此,应加强 对国内蓝舌病流行病学监控工作,同时完善监测诊断技术,提高灵敏度,为我国蓝舌病疫情 的防控奠定良好的基础。
[0004] BTV基因组由十个线性双链RNA组成。与呼肠孤病毒科的其他成员一样,组装在无 囊膜核心颗粒中的双链RNA基因组片段转录为病毒的mRNA。利用转录复合体中的RNA依赖 的RNA聚合酶(VP1蛋白)合成十个完全首尾相连病毒mRNA基因组片段,分别编码7种结 构蛋白(VP1~VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)。NS1蛋白由S5基因编 码,核苷酸长1689bp,编码552个氨基酸,蛋白大小为64kDa。通过对NS1蛋白的氨基酸 序列同源比对发现NS1蛋白在BTV不同血清型之间高度保守,这表明NS1蛋白具有群特异 性抗原的特性。NS1蛋白在BTV感染宿主过程中具有遗传和和抗原稳定性,是BTV复制周 期中表达量最高的细胞质蛋白,其多聚体能够在感染细胞内中形成大量的病毒特异性微管 (直径52. 3nm,lOOOnm),而这一特征在呼肠孤病毒科其他种属中并没有发现。NS1蛋白多聚 体上调包括NS1蛋白的所有病毒蛋白的合成,形成NS1表达的正反馈,进而迅速增加所有病 毒蛋白的合成,使BTV感染哺乳动物后,病毒蛋白的合成能够迅速取代细胞蛋白的合成,成 为细胞质中最多的细胞质蛋白,感染后8个小时病毒蛋白即可成为主要的翻译产物。综上 所述,NS1蛋白在BTV引起细胞病变的过程中起重要作用。所以可以通过制备BTV1-24型 NS1蛋白的群特异性单克隆抗体并鉴定其B细胞表位建立BTV的快速准确的鉴别诊断方法 并进一步研究BTV1-24型的预防与治疗措施。

【发明内容】

[0005] 本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒1-24型NS1蛋白单克隆抗体的杂 交瘤细胞株;
[0006] 本发明目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体,该单克隆抗体 可与BTV1-24型的NS1蛋白均发生特异性反应;
[0007] 本发明目的之三是鉴定蓝舌病病毒NS1蛋白的线性B细胞表位。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0009] 本发明利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白作为 免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以pET-30a原核 表达系统表达纯化的重组NS1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细 胞,最终获得一株稳定分泌抗1-24型BTVNS1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为 BTV-NS1-1F11,分类命名为分泌抗BTV-NS1-1F11单克隆抗体的杂交瘤细胞株,保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其微生物保藏号是:CGMCCN0. 10208 ;保藏时 间:2014年12月23日;保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
[0010] 本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体,命名为 BTV-NS1-1F11,IFA检测结果表明该单克隆抗体与重组BTV12-NS1蛋白及感染BTV1-24的 BHK-21细胞发生特异性反应,与相应阴性对照均不发生反应。
[0011] 本发明利用肽扫描技术对单克隆抗体BTV-NS1-1F11所识别的BTV12-NS1蛋白的 线性B细胞表位进行了鉴定,结果表明:BTV-NS1-1F11所识别的BTV12-NS1蛋白的线性B细 胞表位的氨基酸序列为451KAQRSALLRLFCFVCY466(SEQIDN0. 1所示)。同时,序列比对特异 性鉴定结果显示451KAQRSALLRLFCFVCY466为BTV1-24的群特异性表位。
[0012] 综上所述,本发明制备并鉴定出了一株抗BTV1-24型NS1蛋白的杂交瘤细胞株,实 验证明由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的针对BTV的线性B 细胞表位可用于制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒1-24型感染的试剂与药物,本发 明的提出为建立BTV的鉴别诊断方法以及进一步研究BTV的防治措施奠定了基础。
【附图说明】
[0013] 图1为pET-30a原核系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的SDS-PAGE与Western blot(WB)鉴定;
[0014] 1 :pET-30a空载体;2 :重组BTV12-NS1蛋白超声后沉淀;3 :重组BTV12-NS1蛋白 超声后上清;4 :重组BTV12-NS1蛋白诱导后;5 :重组BTV12-NS1蛋白诱导前;6 :纯化后的 重组BTV12-NS1蛋白(SDS-PAGE) ;7:纯化的重组BTV12-NS1蛋白(WB) ;8:未纯化的重组BTV12-NS1 蛋白(WB);M:标准蛋白Marker。
[0015] 图2为Bac-to-Bac真核杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的 SDS-PAGE与Westernblot鉴定;
[0016] 1 :重组杆状病毒感染Sf9细胞的裂解产物;2 :重组杆状病毒感染Sf9细胞的裂 解产物上清;3 :重组杆状病毒感染Sf9细胞的裂解产物沉淀;4 :纯化的BTV12NS1蛋白 (SDS-PAGE) ;5 :野生型杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞;6 :纯化的BTV12NS1蛋白(WB);M: 标准蛋白Marker。
[0017] 图3为应用IFA检测单克隆抗体BTV-NS1-1F11与BTV1-24型病毒感染的BHK-21 细胞、未接毒的BHK-21细胞的反应性结果;
[0018] 1 :BTVl-24 ;2 :鼠的阳性血清3 :鼠的阴性血清;4 :未接毒的BHK-21细胞。
[0019] 图4为应用Westernblot检测单克隆抗体BTV-NS1-1F11与真核重组重
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