一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶及其基因，以及含有该 基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该短链脱氢酶或含有该酶的重组细胞在不对 称还原一系列潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 手性药物的两种对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，因此， 单一对映体的合成越来越受关注。作为最重要的手性砌块之一，光学活性手性醇被广泛应 用于手性药物和精细化学品的合成之中。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇 的重要方法，理论上能将100%底物酮转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价 值。
[0003] 与化学法不对称还原相比，生物法催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择 性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化通常在温和条件下进行，避免了剧烈化 学反应过程中化合物的异构化、差向异构化、消旋和重排等现象的发生。因此，生物催化法 合成光学活性手性醇已成为最受瞩目的医药及精细化学品的绿色合成技术之一。
[0004] 在具有催化不对称还原潜手性酮活性的酶中，短链脱氢酶由于其催化底物谱广、 热稳定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而倍受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备 高光学纯度手性醇已有诸多报道。Peng等利用源于SerratiamarcescensBCRC10948的 短链脱氢酶不对称还原M3-羟基苯基）-2-(甲氨基）乙酮得到ee值达99%的（R)_苯肾 上腺素（JournalofBiotechnology，2014,170:6-9)。Pennacchio等将源于Sulfolobus acidocaldariusDSM639的短链脱氢酶用于苯偶酰的不对称还原，转化率和产物的ee值 均达到98%(ApplMicrobiolBiotechnol，2013,97(9) :3949-3964)。然而，大多数生物催 化剂催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则，遵循anti-Prelog规则催化潜手性酮 还原的生物催化剂相对较少。这将限制作为手性药物合成重要中间体anti-Prelog手性醇 的制备及生物催化绿色合成技术的推广。因此，发掘新的遵循anti-Prelog规则的生物催 化剂十分必要与迫切。
【发明内容】
[0005] 本发明一个目的在于提供一种短稳杆菌Empedobacterbrevis短链脱氢酶，以达 到能够高效合成高光学纯度手性醇（ee>99% )的目的。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的提供一种短链脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDN0 :2 所示。
[0007] 本发明的短链脱氢酶来源于短稳杆菌ZJUY-1401(Empedobacterbrevis ZJUY-1401)。该菌株由本实验室从土壤中筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏编号为CCTCCΝ0:Μ2014520,保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏时间是2014年10月 29臼。
[0008] 任何对SEQIDNO:2所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个 氨基酸且具有短链脱氢酶活性的，仍属于本发明的保护范围。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种短链脱氢酶基因，其（1)核苷酸序列如SEQID NO:1所示；或⑵编码氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示的蛋白质。
[0010]该基因是通过PCR技术从短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401) 基因组中克隆获得。具体制备方法为：根据Genbank中收录的短链脱氢酶的基因序列设计 合成引物，较佳的，h.游引物为：GCTGAGGATCCATGTCAATATTAAAAGATAAGGTAGC,(SEQIDNo： 3);下游引物为：
[0011]GCATCCTCGAGTTAAACTGCTGTATATCCTCCATC,(SEQIDNo:4);然后以Empedobacter brevisZJUY-1401基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应（PCR)进行基因扩增，获得全长 753bp的短链脱氢酶基因序列。该短链脱氢酶基因核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。该序 列编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0012] 如本领域技术人员所知，本发明的短链脱氢酶基因的核苷酸序列也可以是编码序 列表中SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。任何对SEQ IDN0 :1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序 列，只要其与核苷酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
[0013] 本发明的第三个目的是提供一种包含本发明的短链脱氢酶基因的核苷酸序列的 重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的短链脱氢酶核苷酸序列连 接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病 毒载体等，优选pET-30a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR 扩增所得的短链脱氢酶基因产物EbsdrS与载体pET-30a连接构建本发明的短链脱氢酶基 因重组表达质粒pET30a_Ebsdr8。
[0014] 本发明的第四个目的是提供一种表达重组短链脱氢酶的基因工程菌，可通过将 本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的 各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的短链脱 氢酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。将 重组质粒pET30a-Ebsdr8 转化至E.coliBL21(DE3)中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/ pET30a-Ebsdr8〇
[0015] 本发明的第五个目的是提供一种重组短链脱氢酶的制备方法，包括如下步骤：培 养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组短链脱氢酶。其中，所述的培养重组表达转化体 所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的短链脱氢酶的培养基，优选LB 培养基：蛋白胨l〇g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7. 2。培养方法和培养条件没有特殊 限制，只要使转化体能够生长并产生短链脱氢酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组 大肠杆菌E. coliBL21 (DE3) /pET30a-Ebsdr8接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养 液的光密度〇D6。。达到0. 5~0. 7时，在终浓度为0. 1~1.OmM异丙基-β -D-硫代吡喃半 乳糖苷（IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组短链脱氢酶。
[0016] 本发明的第六个目的提供所述短链脱氢酶或其重组细胞在不对称催化潜手性酮 制备光学活性手性醇中的应用。
[0017] 具体的，所述的应用为：以潜手性酮（I)为底物，所述短链脱氢酶或其重组细胞， 以NADH或NADPH为辅酶，20~50°C下，于pH5. 5~10. 5的缓冲液构成的转化反应体系a 中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。
[0018]
[0019] 其中，R1和R2为氧、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。
[0020] 具体的R1 和R2 可以为-H，-CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2X，-CX3, -X，-0CH3, -0CH2 CH3;X代表F，Cl，Br，0H，N02。
[0021] 所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。
[0022] 进一步，所述转化体系a中底物初始浓度为5~100mmol/L。
[0023] 进一步，所述转化体系a中重组短链脱氢酶纯酶在反应液中较佳的浓度为0. 1~ 2.Omg/mL。所述转化体系a中菌体的质量用量以菌体湿重计为10~400g/L。
[0024] 进一步，所述转化体系a还包括有机溶剂。
[0025] 由底物、催化剂、有机溶剂与pH5. 5~10. 5的缓冲液构成转化体系b，有机溶剂占 转化体系b总体积1~20 %，转化体系b中底物初始浓度为5~100mm〇l/L，菌体的质量用 量以菌体湿重计为10~400g/L。
[0026] 进一步，所述反应在pH6. 5~10. 5的缓冲液中进行。
[0027] 进一步，反应体系还可添加醇或糖作为辅底物，可以显著提高反应的活力和立体 选择性。所述辅底物包括但不限于下列之一：①乙醇、②异丙醇、③葡萄糖、④蔗糖等。
[0028] 其中辅底物醇或糖的质量分数为反应体系总质量的1~15%。
[0029] 进一步，反应体系中的辅底物为异丙醇。
[0030] 进一步，反应体系中异丙醇的质量分数为反应体系总质量的5%。
[0031] 进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化反应液离心，取上 清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应 手性醇。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分 离等。
[0032] 本发明所述转化体系a和转化体系b均为转化体系，为便于区分不同步骤转化体 系的组成不同而命名，字母本身没有含义。
[0033] 本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源于EmpedobacterbrevisCCTCC Ν0:Μ2014520的短链脱氢酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化 体，通过该短链脱氢酶或含有该酶的基因工程菌，即重组细胞，可以不对称还原可制备高光 学纯度的手性醇。
[0034] 本发明中短链脱氢酶或含有该酶的重组细胞不对称还原制备手性醇具有显著优 点，能够合成高光学纯度手性醇（ee>99%)。催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性 广、环境友好，且其重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化潜手 性酮的不对称还原，具有很好的工业化应用开发前景。
【附图说明】
[0035] 图1为实施例1中短链脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0036] 图2为实施例1中pET30a_Ebsdr8重组质粒物理图谱。
[0037] 图3为实施例3中短链脱氢酶分离纯化SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0039] 实施例1:EmpedobacterbrevisZJUY-1401短链脱氢酶基因的获得、重组质粒构 建及转化大肠杆菌
[0040] 用DNA提取试剂盒提取EmpedobacterbrevisZJUY-1401菌体的全基因组DNA, 以该DNA为模板，上游引物(GCTGAGGATCCATGTCAATATTAAAAGATAAGGTAGC)和下游引物（GCA TCCTCGAGTTAAACTGCTGTATATCCTCCATC)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组 分加入量（总体积 50μL) :5XPrimeSTAR?HSDNApolymeraseBuffer10μL，10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2. 5πιΜ)4μL，浓度为50μΜ的上游引物、下游引物各 1μL，基因组DNA1μL，PrimeSTAR?HSDNApolymerase0· 5μL，无核酸水 32. 5μL。PCR 反应条件为：预变性98°Clmin，然后进入温度循环98°C10s，56°C15s，72°Clmin