一种脂肪酶lipase7及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶LIPASE7及其编码基 因和应用。
【背景技术】
[0002] 手性化合物由于立体结构互为镜像，其在生物学和药学性质上却相差甚远。比如 历史上曾出现使用反应停导致大规模新生儿畸形的事件，由于合成手性药物过程中存在两 种构型的"反应停"，R型的"反应停"是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的"反应停"对胎儿 则有致畸作。因此，得到光学纯度的手性化合物是非常重要的。
[0003]目前合成手性化合物的方法主要有：（1)化学法，即利用对映体的物理和化学性 质的差异进行分离。通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的 性质差异要大，适用的化合物不多。（2)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合 成。这种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机 溶剂。（3)色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是 设备昂贵，普及性较差。（4)酶拆分：这也是目前手性药物发展的一个朝阳方向。
[0004] 脂肪酶（Lipase，EC3. 1. 1. 3)，又叫作三酰甘油水解酶，由其来源非常广泛（微生 物、植物和动物中都有存在），可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子，是一种重 要的手性催化剂。
[0005] 光学纯的2-氯丙酸甲酯是制备光学纯的芳氧基丙酸类除草剂及一些手性药物 (如左西孟旦）的重要的中间体。然而，由2-氯丙酸甲酯外消旋体为原料作为中间体进行 合成医药或农药，由于其含有低效或无效或有毒副作用的对映异构体，可能以竞争性抑制 剂的形式起作用，不仅会降低药效，而且会造成原料的浪费，还可能产生毒副作用等。
[0006] 光学纯的2-氯丙酸乙酯作为一种重要的医药、农药手性中间体是合成光学纯芳 氧丙酸类除草剂、植物生长调节剂以及一些杀菌剂的重要原料；也是α-取代丙酸系列除 草剂、植物生长调解剂、非留体类消炎解热镇痛药的重要中间体，如禾草灵，吡氟禾草灵等。
[0007] 但是，目前在工业中应用的脂肪酶都是来源于进口，比如NovoNordisk公司的 月旨肪酉每Novozym435 (来自Candidaantarctica)，AmanoPharmaceutical公司的Lipase PS(来自Burkholderiacepacia)，Fluka公司的LipaseA(来自Candidaantarctica)等 等。这些脂肪酶价格昂贵，生产技术受到制约，因此开发具有自主产权的拆分活性好的脂肪 酶十分必要。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提 供一种新的脂肪酶LIPASE7及其编码基因和应用。
[0009] 本发明从海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299 中开发了 一种新的脂肪酶LIPASE7及其编码基因lipase7,构建了含有脂肪酶基因lipase7的重 组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPASE7,其可应用于制备手性 (R)-2-氯丙酸甲酯和（R)-2-氯丙酸乙酯。
[0010] 本发明的第一目的是提供一种脂肪酶LIPASE7,其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所 不。
[0011] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶LIPASE7的脂肪酶基因 lipase7〇
[0012] 优选，所述的脂肪酶基因lipase7的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0013] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase7的重组表达载体。所述的表达 载体，优选pET28a(+)载体。
[0014] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase7的基因工程菌。所述的基因工 程菌，优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0015] 本发明的第三个目的是提供所述的脂肪酶LIPASE7在制备手性（R)-2-氯丙酸甲 酯或（R)-2-氯丙酸乙酯中的应用。
[0016] 优选，脂肪酶LIPASE7在拆分（±)-2_氯丙酸甲酯制备得到（R)-2-氯丙酸甲酯中 的应用。
[0017] 进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE7于pH为6. 0-9. 0的缓冲液中，再加入 (±) -2-氯丙酸甲酯及其助溶剂，进行反应，得到（R) -2-氯丙酸甲酯。
[0018] 优选，脂肪酶LIPASE7在拆分（±)-2_氯丙酸乙酯得到（R)-2-氯丙酸乙酯中的应 用。
[0019] 进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE7于pH为6. 0-9. 0的缓冲液中，再加入 (±)-2_氯丙酸乙酯及其助溶剂，进行反应，得到（R)-2-氯丙酸乙酯。
[0020] 所述的缓冲液，优选为柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸缓冲液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH 缓冲液中的一种。
[0021] 所述的助溶剂，优选为正癸醇、正丁醇、乙醇、异丙醇、环己酮、环己烷、正己烷、正 庚烧和异辛烧中的一种。
[0022] 本发明的脂肪酶基因lipase7来自于海洋放线菌（Pseudonocardia antitum〇ralis)SCSI0 01299,保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明用生 物信息学分析的方法，从基因组测序的海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis) SCSI0 01299中得到脂肪酶基因lipase7,全长为927bp(从起始密码子到终止密码子）， 其编码的脂肪酶LIPASE7,共包含308个氨基酸；该基因是一个全新的脂肪酶基因，与其它 脂肪酶基因序列的最大相似度为42%。通过克隆脂肪酶基因lipase7并将其连接表达载 体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶 LIPASE7。脂肪酶LIPASE7作为催化剂拆分（±)-2-氯丙酸甲酯，可制备得到99%光学纯度 的（R)-2_氯丙酸甲酯；脂肪酶LIPASE7作为催化剂拆分（±)-2_氯丙酸乙酯，可得到98% 光学纯度的（R)-2_氯丙酸乙酯。脂肪酶LIPASE7具有稳定性高、催化效率高的优点，可用 于生物医药、化妆品和精细化工等领域。
[0023] 本发明的海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299 公开于专利 号：ZL201110231994. 4、发明名称为：一种假诺卡氏菌及利用其制备Deoxynyboquinone的 方法的专利中，本发明的海洋放线菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299即为 上述专利中的假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.SCSIO01299,其于2011年7月18日保藏于 中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCN0:M 2011255。
【附图说明】
[0024] 图1是不同侧链长度的对硝基苯酚酯对脂肪酶LIPASE7酶活的影响。
[0025] 图2是脂肪酶LIPASE7的最适pH及pH稳定性，A为最适pH曲线图，B为pH稳定 性曲线图。
[0026] 图3是脂肪酶LIPASE7的最适反应温度和温度稳定性，A为最适反应温度曲线图， B为温度稳定性曲线图。
[0027] 图4是脂肪酶LIPASE7拆分（±)-2_氯丙酸甲酯反应GC图，A为样品（±)-2_氯 丙酸甲酯气相图，B为脂肪酶LIPASE7拆分（±)-2_氯丙酸甲酯反应20min后的气相图，其 中S代表（S)-2-氯丙酸甲酯，R代表（R)-2-氯丙酸甲酯；
[0028] 图5是脂肪酶LIPASE7拆分（±)-2_氯丙酸乙酯反应GC图，A为样品（±)-2_氯 丙酸乙酯气相图，B为脂肪酶LIPASE7拆分（±)-2_氯丙酸乙酯反应60min后的气相图，其 中S代表（S)-2-氯丙酸乙酯，R代表（R)-2-氯丙酸乙酯。
[0029] 图6是脂肪酶LIPASE7的蛋白表达纯化情况，Μ为蛋白Marker，l为未经IPTG 诱导的含有pET-28a(+) -lipase7的大肠杆菌BL21 (DE3)，2为经IPTG诱导的含有 pET-28a(+)-lipaSe7的大肠杆菌BL21 (DE3)，3为Ni柱纯化后得到的脂肪酶LIPASE7,4为 经过脱盐柱后的脂肪酶LIPASE7。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例是对本发明的进一步说明，