一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大肠杆菌热敏性肠毒素的制备领域，具体涉及一种重组大肠杆菌热敏 性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌热敏性肠毒素（Escherichiacoliheat-labileenterotoxin，LT)虽然 是一种蛋白，但也是一种很强的黏膜免疫原，经黏膜途径免疫时，能刺激机体产生大量针对 该毒素的抗体，而且在与其他抗原同时免疫或者与其他蛋白融合表达后免疫时，还能刺激 机体产生针对该抗原的抗体和黏膜IgA，起到佐剂的功能，被认为是目前最具潜力的黏膜佐 剂之一。
[0003] 用作佐剂时，LT可以促进机体产生比较平衡的Thl和Th2反应，可刺激机体产生 高水平的针对共同免疫抗原的黏膜IgA和血清IgG，而且免疫反应持久。
[0004]LT是AB5型的毒素，B亚基介导毒素与哺乳动物细胞表面受体结合，而A亚基则具 有具有腺苷酸酶活性，可引起人和动物水样腹泻。作为一种毒素，LT的毒性制约了其应用， 从发现LT的佐剂功能三十年来，研究人员一直尝试将其毒性和佐剂功能分开，主要是通过 基因工程的方法对LT进行点突变来制备LT的减毒甚至无毒突变体，后来还发现单独的LTB 也具有佐剂功能，而且将LTB与其他一些基因串联表达时，也能起到很好的佐剂功能。
[0005] 中国专利CN101560247对LT进行了双突变，并构建了双突变重组LT的原核表达 载体pET30a-LTRG(R72G192)，诱导表达后重组LT的A亚单位以包涵体形式表达而B亚单位 以可溶性形式表达，蛋白变复性后具有良好的佐剂功能。但蛋白后续复性过程比较繁琐，且 复性过程中有大量蛋白损失。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备 方法，选择冷休克载体pcoldll，利用冷休克基因CSPA获得高效的表达能力，对大肠杆菌热 敏性肠毒素突变体（LTRG，下同）基因进行可溶性表达，提高了可溶性表达的量，并且蛋白 质经诱导表达后不需进行变性和复性，省掉了蛋白质变性及复性的繁琐过程，避免了变性 及复性过程中的蛋白质的损失。
[0007] 为了达到以上目的，本发明的技术方案是：
[0008] -种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达载体，其为利用冷休克载体 pcoldll与LTRG基因构建的表达载体pcoldll-LTRG，并且所述的LTRG基因的A亚基C端 和B亚基的N端上均引入了His标签。
[0009]进一步，构建表达载体pcoldn-LTRG的方法，包括：
[0010]1)设计引物：参照表达载体pcoldll的多克隆位点序列和LTRG基因序列设计引 物L1F和L1R，并引入PstI和Xhol酶切位点；所述引物序列L1F和L1R分别如SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 所示：
[0011] 2)以质粒pET30a-LTRG为模板，进行PCR扩增，得到A亚基C端和B亚基的N端均 带有His标签的LTRG基因的目的片段；
[0012] 3)将冷休克载体pcoldll及步骤2)中的目的片段分别进行双酶切，再将酶切片段 用连接酶连接，获得表达载体pcoldll-LTRG，将其转化到克隆菌DH5a中扩增，并进行双酶 切验证；
[0013] 本发明提供的一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的制备方法，包括如下 步骤：
[0014] 1)构建表达载体pcoldll-LTRG;
[0015] 2)将表达载体pcoldll-LTRG转化到BL21 (DE3)感受态菌并进行IPTG诱导表达， 添加IPTG后，诱导温度为15~16°C，时间为12~24小时，获得目的蛋白；
[0016] 3)将目的蛋白在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析进行纯化，用PBS缓冲液 和咪唑洗脱缓冲液配制清洗液，洗脱获得纯化的目的蛋白；纯化过程中所用缓冲液均预冷 至4~8。。。
[0017] 所述步骤3)的清洗液中咪唑洗脱缓冲液的含量为25~40% (体积比），咪唑的 浓度为 125mmol/L~200mmol/L。
[0018] 本发明所述的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因的突变位点为大肠杆菌热 敏性肠毒素LT的A亚基上第72位由丙氨酸A突变为精氨酸R，第192位由精氨酸R突变为 甘氨酸G。
[0019] 本发明所述的目的蛋白即重组LTRG蛋白，是大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG 基因经诱导表达后的获得的蛋白质。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 1.本发明选择的表达载体对LTRG重组蛋白进行可溶性表达，表达的产物不需进 行变性和复性，省掉了蛋白质变性和复性的繁琐过程，也避免了变性和复性过程中蛋白质 的损失。
[0022] 2.本发明选择冷休克表达载体pcoldll，利用冷休克基因CSPA的启动子设计高效 率的蛋白质表达载体，在CSPA的启动子的下游处，插入了lac操纵子，以便严格控制表达， 当培养的大肠杆菌的温度充分降低，几乎暂时停止生长，大部分的蛋白表达减少，由于5'非 翻译区（5'UTR)，翻译增强元件（TEE)，His标签序列和多克隆位点（MCS)位于CSPA启动子 的下游，此时克隆到冷休克基因下游多克隆位点中的的LTRG基因被专门诱导表达。
[0023] 本发明在构建表达载体时，在大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因的A亚基C 端和B亚基的N端引入His标签，由于在目的蛋白上引入了His标签而且该蛋白以可溶形 式表达，故在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析纯化，用咪唑梯度浓度洗脱获得纯化 的目的蛋白，纯化过程中所用缓冲液均预冷至4°C，能有效减少蛋白质的降解。
【附图说明】
[0024] 图1为LTRG基因的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图；
[0025]其中，M.DNAMarkerDL2000 ;1·PCR扩增的LTRG基因产物。
[0026] 图2为pcoldll-LTRG质粒双酶切后的核酸电泳图；
[0027]其中，M:DNAMarkerDL2000/DL1500 ;1:双酶切后的pcoldll-LTRG质粒；2:未酶 切的pcoldll-LTRG质粒；3、4:pcoldII质粒。
[0028]图 3 为pcoldll-LTRG诱导表达后SDS-PAGE结果；
[0029]其中，1 :pcoldII-LTRG诱导前；2 :pcoldII-LTRG诱导破碎后上清；3: pcoldll-LTRG诱导破碎后沉淀。
[0030] 图4为蛋白诱导表达后WesternBlot验证结果；
[0031] 其中，Μ:蛋白Marker;1:以抗His-tag单抗作为一抗；2:以抗CTB单抗作为一抗。
[0032] 图5为LTRG蛋白诱导表达和纯化结果；
[0033] 其中，1:蛋白Marker;2:诱导前；3-5:诱导后；6:纯化后。
【具体实施方式】
[0034] 为了进一步了解本发明，下面结合实施例和附图对本发明优选实施方案进行描 述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利 要求的限制。
[0035] 本发明实施例中所用到的主要材料、试剂及仪器列举如下：
[0036]DH5a、BL21 (DE3)、pcoldll表达载体、PstI、Ncol限制性内切酶Taq酶、T4DNA连 接酶、DNAMarker和蛋白质Marker为大连宝生物公司产品，羊抗CTB单抗和鼠抗His-tag 单抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0037]pET30a_LTRG质粒为本实验室构建保存。质粒小量抽提试剂盒、DNA回收试剂盒为 Axygen公司产品；酵母粉、胰蛋白胨为oxide公司产品；蛋白纯化仪为GEAKTApurifierlO; 其他试剂均为国产分析纯。
[0038] 实施例1pcoldll-LTRG表达载体的构建
[0039] 1.引物设计
[0040] 以pET30a-LTRG为模板，参照pcoldll表达载体的多克隆位点序列和LTRG序列设 计引物，标记为L1F和L1R，下划线部分分别为PstI和Xhol酶切位点，引物由生工生物工程 (上海）股份有限公司合成；
[0041]L1F:5，-ccgetcgagaatggcgacagattatac_3，
[0042]L1R：5,~aactgcagttagtggtggtggtggtggtggtttttcatactgatt gc-3,。
[0043]弓丨物L1F和L1R可从pET30a-LTR