一种表达载体的制作方法

文档序号:9485194阅读:1215来源:国知局
一种表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域,涉及一种表达载体。
【背景技术】
[0002] -些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重 组蛋白异源表达的重要宿主(Cherezov等,2007 ;Imasaki等人,2011 ;Rasmussen等人, 2007;White等人,2012),(Metz和Pijlman,2011;Shrestha等人,2007;Treanor等人, 2011 ;Treanor等人,2011年)。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来感染源 自鳞翅目的细胞系。(Berger等人,2004 ;Jarvis,2009;Kost等人,2005 ;Summers,2006) 〇 最常用的宿主是来自于Spodopterafrugiperda的Sf21和Sf9以及来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞系(又称HighFive或Tn-5)。这些细胞能在悬浮培养下生长到 很高的细胞密度,并且能够执行翻译后的蛋白质修饰,包括Ν-和0-端糖基化(Kost等人, 2005 ;贾维斯,2009)。当使用BEVS用于基因递送时,Tn-5细胞是生产分泌蛋白质的优选宿 主(Drugmand等人,2012;Granados等人,1994)。
[0003] 尽管BEVS的运用非常成功,其还是存在几个缺点。杆状病毒载体的生成将可能需 要长达3个星期(Jarvis,2014年)。因为病毒引起的细胞裂解,蛋白生产阶段的持续时间 被限制在约3-4天以内。分泌蛋白和细胞表面蛋白的通常产量往往小于10μg/mL,而细胞 内蛋白质的产量已经有报道达到了 100μg/mL(Harrison和Jarvis,2007 ;Jarvis,2009)。 可以通过稳定转染昆虫细胞系来替代使用BEVS瞬时生产蛋白质的方法。但是,这种方法不 仅费时,而且蛋白产量通常很低(Harrison和Jarvis,2007 ;Drugmand等人,2012)。
[0004] 通常使用BEVS来构建表达载体是将目的基因人工连接于杆状病毒的晚期(late) 和/或非常晚期(verylate)启动子之后,利用其强力启动子,以期能表达较大量的目标蛋 白。但该方法存在非常明显的缺陷,即通常在晚期(late)或非常晚期(verylate)启动子 开始表达之后,宿主细胞将在两三天内快速死亡,无法达到长期表达的目的。

【发明内容】

[0005] 本发明目的之一在于提供一种能长时间稳定大量表达目的基因的表达载体。
[0006] 本发明目的之二在于提供含上述表达载体的宿主细胞。
[0007] 本发明目的之三在于提供一种利用上述载体制备重组蛋白的方法及其获得的蛋 白。
[0008] 发明通过以下技术方案实现:
[0009] 首先,发明提供了一种表达载体,包含至少一个调控单元,所述调控单元含有:
[0010] a.hrx增强子或其功能片段或序列变体;
[0011]b.AcIEx启动子或其功能片段或序列变体;和
[0012] c. 0piex启动子或其功能片段或序列变体。
[0013] 所述的hrj强子为AcMNPV中的hr5增强子、Bombyxmori中的hr3增强 子,AcMNPV中的hr3增强子;优选地,为AcMNPV的hr5增强子。
[0014] 所述的AcIE$动子为AcMNPV中的AcIE1启动子。
[0015] 所述的Opieja动子为OpMNPV中的0pie2启动子、Opiel启动子;优选地,为 OpMNPV中的0pie2启动子。
[0016] 优选地所述hrdi强子、AcIEx启动子功能片段和Opiex启动子依次连接。
[0017]AcIE:启动子:
[0018] 优选地,所述AcIEx启动子功能片段为AcIEx启动子序列的01为到352位;优选 01为到188位;更优选01为到119位。
[0019] 在本发明的一个优选的实施方案中,采用了AcIEl启动子。作为可选的方案,可采 用如SEQNOID. 7所示序列或与其具有70%以上同源,优选80%以上同源,更优选90%以 上同源,更优选95%以上同源,最优选98%以上同源的序列。在本发明的一个优选的实施 例中,采用了如SEQNOID. 7所示序列。
[0020] Opie^启动子:
[0021] 可选地,所述0pie:^动子可采用如SEQNOID. 6第614-1161所示序列或与其具 有70%以上同源,优选80%以上同源,更优选90%以上同源,更优选95%以上同源,最优选 98%以上同源的序列。在本发明的一个优选的实施例中,采用了如SEQNOID. 6第614-1161 所示序列。
[0022] hr^增强子:
[0023] 作为可选的方案,可采用如SEQNOID. 6第1-482所示序列或与其具有70%以上 同源,优选80%以上同源,更优选90%以上同源,更优选95%以上同源,最优选98%以上同 源的序列。
[0024] 在本发明的一个优选的实施例中,采用了如SEQNOID. 6第1-482所示序列。
[0025] 含优诜的调棹单元的载体示例:
[0026] 作为一种优选的方案,本发明通过提供一种操作性连接于编码所需重组蛋白的异 源基因序列的含有AcMNPV中的AcIEl启动子片段和hr5增强子,以及OpMNPV的0pie2启动 子的昆虫细胞表达载体而得到解决。所述hr5增强子加位于hr5增强子下游的AcIEl启动 子片段和0pie2启动子构成了驱动下游编码序列表达的调控单元。本发明的昆虫细胞表达 载体是由AcMNPV的立即早期启动子AcIEl启动子片段和OpMNPV的立即早期启动子0pie2 启动子控制,从而能在宿主细胞中保持长期的表达,而不会造成宿主细胞的死亡。令人惊喜 的是,本发明载体的表达盒中包含的与AcIEl启动子片段和hr5增强子组合的0pie2启动 子驱动的异源蛋白产物表达水平高于只含有AcIEl启动子和hr5增强子的载体所见水平。 发明人认为0pie2启动子的存在明显促进了从相应的mRNA有效合成蛋白。
[0027] 在本发明的一个特别优选的实施例中,本发明载体的序列如SEQNOID. 6所示。
[0028] 除了编码重组或异源基因产物的DNA序列外,该表达载体还包含在宿主细胞中能 有效转录编码序列的mRNA和有效翻译所述mRNA所必需的调控DNA序列。具体说,本发明 的表达载体包含至少一个调控单元,其包含操作性连接于重组蛋白编码序列的与AcIEl启 动子片段和hr5增强子联合的至少一个0pie2启动子序列,并驱动编码蛋白的表达。包含 AcIEl启动子片段和hr5增强子及0pie2启动子的所述调控单元与异源基因的编码序列直 连,或通过间插的DNA(例如:通过异源基因的5'非翻译区或其一部分)而与异源基因的编 码序列分隔。
[0029] "启动子"定义为一种通过引导RNA聚合酶连接到DNA并启动RNA合成来介导转录 起始的DNA序列。
[0030] 本发明优选采用的AcIEl启动子也可以是AcIEl启动子的功能性片段或其功能 性序列变体。因此,具有介导转录起始功能或能介导转录起始从而能瞬时或稳定地驱动 重组或异源产物基因表达的AcIEl启动子的任何序列变体或片段均可用作AcIEl启动子。 AcIEl启动子的"功能性变体"包括含有碱基插入、删除或点突变的天然AcIEl序列,可用本 领域熟知方法产生,如引物-定向PCR、'易错PCR'、重叠DNA片段的被称为'基因重组'的 PCR-重装,或先在体内随机诱变细胞克隆,再经文库转染和在Tn-5细胞中进行功能性选择 来产生。例如,随机诱变或通过烷化化学试剂或UV辐射来实现。任选地,可以采用宿主菌 的天然突变菌株。优选地,此类变体序列的DNA与天然AcIEl启动子对应部分至少65 %同 源、更优选地,75%同源、最优选地90%同源。IE1启动子功能性序列变体的例子是含有转 录起始位点的经基因工程改造而设置了合适的限制性位点用于插入重组产物基因的启动 子序列。
[0031]本发明所用的0pie2启动子也可以是0pie2启动子的功能性片段或其功能性序列 变体。因此,具有介导转录起始功能或能介导转录起始从而能瞬时或稳定地驱动重组或异 源产物基因表达的〇Pie2启动子的任何序列变体或片段均可用作Opie2启动子。Opie2启动 子的"功能性变体"包括含有碱基插入、删除或点突变的天然0pie2序列,可用本领域熟知 方法产生,如引物-定向PCR、'易错PCR'、重叠DNA片段的被称为'基因重组'的PCR-重装, 或先在体内随机诱变细胞克隆,再经文库转染和在Tn-5细胞中进行功能性选择来产生。例 如,随机诱变或通过烷化化学试剂或UV辐射来实现。任选地,可以采用宿主菌的天然突变 菌株。优选地,此类变体序列的DNA与天然0pie2启动子对应部分至少65%同源、更优选 地,75%同源、最优选地90%同源。0pie2启动子功能性序列变体的例子是含有转录起始位 点的经基因工程改造而设置了合适的限制性位点用于插入重组产物基因的启动子序列。
[0032]本发明优选采用的hr5增强子也可以是其功能性片段或功能性序列变体。因此, 具有AcIEl启动子和0pie2启动子转录活性功能或能增强AcIEl启动子和0pie2启动子转 录活性的hr5增强子的任何序列变体或片段均可用作hr5增强子。Hr5增强子的"功能性 变体"包括含有碱基插入、删除或点突变的天然hr5序列。
[0033]本
【发明内容】
中,术语"异源编码序列"、"异源基因序列"、"异源基因"、"重组基因"、 "感兴趣的基因"和"转基因"可互换使用。这些术语用于DNA序列时指编码重组或异源基 因产物的DNA序列。所述异源基因序列在宿主细胞中天然不存在而且来自不同种的生物。 可使本发明的重组或异源基因产物在昆虫细胞中表达和大量收集。所述基因产物也可以是 肽或多肽,可以是任何感兴趣的蛋白质,如治疗蛋白质(如白介素)或酶或多聚蛋白质的亚 单元(如抗体或其片段)。所述重组产物的基因可包含信号序列,其编码的信号肽可使宿主 生产细胞表达的多肽分泌出来。因此,在本发明的进一步优选实施方式中,产物蛋白是为分 泌蛋白质。更优选地,所述产物蛋白是抗体或工程改造的抗体或其片段,最优选是人肿瘤坏 死因子受体-Fc融
当前第1页1 2 3 4 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1