Flt3基因多态性检测引物体系及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] FLT3基因即FMS样酪氨酸激酶3 (Fms-liketyrosinekinase3)也称为胎肝激酶 2(fetalliverkinase-2)或人干细胞激酶 1(humanstemcellkinase-l，STK_l)，与集落 刺激因子1受体（CSF1R或FMS)、血小板衍化生长因子（PDGFR)、干细胞因子受体（KIT)等 同属于III型受体酪氨酸激酶（classIIIreceptortyrosinekinase,RTKIII)家族。近年研 究发现，FLT3基因突变与急性髓系白血病（AML)的发生、预后紧密相关，对FLT3的检测已 成为白血病诊断和预后的重要指标。研究显示AML中FLT3突变的频率达到24. 3%，主要包 括FLT3ITD及FLT3 (3.2503、(：.2504、(3.2505、(3.2506 位点的点突变等。
[0003] FLT3ITD为FLT3基因内部串联重复突变，通过变性高效液相色谱、毛细管电泳、 直接测序、变性聚丙烯酰胺电泳、高分辨率熔解曲线等均可进行有效检测；而涉及到FLT3 多个点突变检测，按照常规一般会采用探针检测，费时费力且花费大，目前尚无有效而经济 的检测产品。因此，开发一种检测FLT3基因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、 更方便快捷的FLT3基因多态性检测是非常有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的FLT3基因多态性检测试 剂盒，以及其检测引物和检测体系。
[0005] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种FLT3基因多态性检测 引物，包括针对FLT3基因c. 2503位点为G情况的正向引物，针对FLT3基因c. 2503位点为 C情况的正向引物，针对FLT3基因c. 2504位点为A情况的正向引物，针对FLT3基因c. 2504 位点为C情况的正向引物，针对FLT3基因c. 2505位点为T情况的正向引物，针对FLT3基 因c. 2505位点为A情况的正向引物、针对FLT3基因c. 2506位点为A情况的正向引物，针 对FLT3基因c. 2506位点为T情况的正向引物，对应FLT3基因c. 2503、c. 2504、c. 2505和 c. 2506位点的反向通用引物，检测β-actin基因的正向引物，以及检测β-actin基因的 反向引物；所述针对FLT3基因c. 2503位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 1所示；所述针对FLT3基因c. 2503位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 2所示；所述针对FLT3基因c. 2504位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 3所示；所述针对FLT3基因c. 2504位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 4所示；所述针对FLT3基因c. 2505位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 5所示；所述针对FLT3基因c. 2505位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 6所示；所述针对FLT3基因c. 2506位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 7所示；所述针对FLT3基因c. 2506位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQID No. 8所示；所述对应FLT3基因c. 2503、c. 2504、c. 2505和c. 2506位点的反向通用引物的 核苷酸序列如SEQIDN0.9所示；所述检测β-aCtin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo. 10所示；所述检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 11所示。
[0006] 各引物应用于PCR反应体系中的终浓度为0. 4μΜ。
[0007] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 FLT3基因多态性检测试剂盒。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种FLT3基因多态性检测 体系，包括用于检测FLT3基因c. 2503位点为G情况的PCR反应体系Α，用于检测FLT3基因 c. 2503位点为C情况的PCR反应体系Β，用于检测FLT3基因c. 2504位点为Α情况的PCR反 应体系C，用于检测FLT3基因c. 2504位点为C情况的PCR反应体系D，用于检测FLT3基因 c. 2505位点为T情况的PCR反应体系E，用于检测FLT3基因c. 2505位点为A情况的PCR反 应体系F，用于检测FLT3基因c. 2506位点为A情况的PCR反应体系G，用于检测FLT3基因 c. 2506位点为T情况的PCR反应体系H，以及用于检测β-actin基因作为内对照的PCR反 应体系I;所述PCR反应体系A包括针对FLT3基因c. 2503位点为G情况的正向引物、对应 FLT3基因c. 2503位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板；所述PCR反应体系 B包括针对FLT3基因c. 2503位点为C情况的正向引物、对应FLT3基因c. 2503位点的反向 通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板；所述PCR反应体系C包括针对FLT3基因c. 2504 位点为A情况的正向引物、对应FLT3基因c. 2504位点的反向通用引物、SYBRGreen混合 液和DNA模板；所述PCR反应体系D包括针对FLT3基因c. 2504位点为C情况的正向引 物、对应FLT3基因c. 2504位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板；所述PCR 反应体系E包括针对FLT3基因c. 2505位点为T情况的正向引物、对应FLT3基因c. 2505 位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板；所述PCR反应体系F包括针对FLT3 基因c. 2505位点为A情况的正向引物、对应FLT3基因c. 2505位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系G包括针对FLT3基因c. 2506位点为A情况 的正向引物、对应FLT3基因c. 2506位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系Η包括针对FLT3基因c. 2506位点为T情况的正向引物、对应FLT3基因 c. 2506位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板；所述PCR反应体系I包括检 测β-actin基因的正向引物、检测β-actin基因的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模 板；所述针对FLT3基因c. 2503位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所 示；所述针对FLT3基因c. 2503位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 示；所述针对FLT3基因c. 2504位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所 示；所述针对FLT3基因c. 2504位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所 示；所述针对FLT3基因c. 2505位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所 示；所述针对FLT3基因c. 2505位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所 示；所述针对FLT3基因c. 2506位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 7所 示；所述针对FLT3基因c. 2506位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 8所 示；所述对应FLT3基因c. 2503、c. 2504、c. 2505和c. 2506位点的反向通用引物的核苷酸序 列如SEQIDNo. 9所示；所述检测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 10 所示；所述检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 11所示。
[0009] 各PCR反应体系的体积为10μ1 ;其中，所述SYBRGreen混合液的体积是5μ1，各 引物的终浓度为0. 4μΜ，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/μ1，其余为纯水。
[0010] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的FLT3基因多态性检测试剂盒。
[0011] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系的 结果判定方法，具体步骤如下：
[0012] 第一步，采用PCR反应体系I检测样本的β-actin基因，
[0013] 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测；
[0014] 若样本扩增CT值范围在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断；
[0015] 第二步，分四组，采用PCR反应体系A和B分别检测该样本的c. 2503位点的情况， 采用PCR反应体系C和D分别检测该样本的c. 2504位点的情况，采用PCR反应体系E和F 分别检测该样本的c. 2505位点的情况，采用PCR反应体系G和Η分别检测该样本的c. 2506 位点的情况；
[0016] 若各组相应两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内：当两者CT差值的绝 对值< 2时，样本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果 不可信，重新制备样本进行检测；
[0017] 若各组相应两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为 结果不可信，重新制备样本进行检测。
[0018] 本发明具有积极的效果：
[0019] (1)本发明的FLT3基